了解用于双光子和三光子激发的天博体育中国官方网站源

双天博体育中国官方网站和三天博体育中国官方网站激发的好处

双光子激发是一种完善的三维成像工具，现在广泛应用于生命科学领域，尤其是神经科学领域。 超快（通常是飞秒）天博体育中国官方网站聚焦成小束腰。 在这个位置（也只有这个位置）上的高峰值强度，能够驱动荧光染料、蛋白质和内源性材料的双光子激发。 通过对这个天博体育中国官方网站点进行 xyz 坐标扫描，可以建立一个二维图像切片或三维图像立方体，具有高信噪比，而对活体组织的热影响最小。

为了对大脑皮层进行更深的神经元成像，三天博体育中国官方网站激发在神经科学界越来越受欢迎。

双光子和三光子激发在脉冲能量、波长、重复频率和脉冲宽度方面均有独特的天博体育中国官方网站要求。，基本的双光子和三光子实验技术不能由同一光源解决。

双光子显微成像的天博体育中国官方网站要求

生物样本的双天博体育中国官方网站激发需要短脉冲、能够快速光栅成像的高重复频率、适合样本生活力的平均功率以及与多种不同可用探针的激发光谱相匹配的波长。 生物样本的双天博体育中国官方网站激发需要短脉冲、能够快速光栅成像的高重复频率、适合样本生活力的平均功率以及与多种不同可用探针的激发光谱相匹配的波长。）

50-100 MHz的固定重复频率运行

最常用的指示剂在波长400到550纳米（紫光到绿光）之间的单天博体育中国官方网站机制下激发。之间的单天博体育中国官方网站机制下激发。

表1：多光子激发优化天博体育中国官方网站参数总结。

最后，许多研究表明，大多数样本在这些近红外波长下能够耐受平均，大多数样本在这些近红外波长下能够耐受平均100-200mW，这样的功率与当今各种成像和功能性荧光探针相配合，这样的功率与当今各种成像和功能性荧光探针相配合，足以提供明亮的图像。10％，这意味着需要1-2

如表1所述，一体化全自动可调谐钛宝石（ti：s）天博体育中国官方网站器（例如（ti：s）天博体育中国官方网站器（例如（coherent chemeleon）（Chereent Chameleon系列），全球各地的实验室中总，全球各地的实验室中总共5,000台此类钛宝石天博体育中国官方网站器用于双光子显微成像。

三光子显微镜的天博体育中国官方网站源要求

与双天博体育中国官方网站显微成像相比，三天博体育中国官方网站显微镜仍处于相对初级阶段。），其使用量正在相当迅速地增长。

三光子事件发生的概率要低得多，这就决定了需要比双光子激发高得多的峰值功率：高出约100-200倍。/或脉冲能量较高的天博体育天博体育中国官方网站官方网站器/或脉冲能量较高的天博体育天博体育中国官方网站官方网站器，可以实现更高的峰值功率。，当通过显微镜系统传输最短的可用锁模脉冲（例如，当通过显微镜系统传输最短的可用锁模脉冲（例如10 fs）（10 fs），色散管理（避免畸变和展宽的脉冲，色散管理（避免畸变和展宽的脉冲）

这个脉冲持续时间大约只有双光子天博体育中国官方网站器典型脉冲持续时间的三分之一，这意味着与这些天博体育中国官方网站器相比，我们仍然需要将脉冲能量提高40-50倍。10-40nj范围内

达到此脉冲能量的一种方法是，使用啁啾脉冲放大（CPA）技术放大钛宝石天博体育中国官方网站器的输出。CPA技术由GerardMourou donna strickland 在二十世纪九十年代发明；这一技术具有重大意义，得到了极为广泛使用，2018年

镱是功率缩放的关键

那么重复频率和平均功率呢？这里主要考虑的是样本活力。，样本承受的平均功率应保持在，200 mw以下，以保持样本的活力。，以保持样本的活力。，我们指出三天博体育中国官方网站成像所需的每个脉冲能量应比双天博体育中国官方网站激发高40-50-50 - 比如-比如1-2MHz。为了提高成像速度

遗憾的是

图1通过示意图说明了这类掺镱光纤放大器的典型结构。， + +前置放大器）（AOM）对这一脉冲串进行门控，并将重复频率降低一个整数n。参考图中所示，如果n = 50，1 MHz的脉冲串将在功率放大阶段由

这种架构非常灵活且功率可扩展；它可以很容易地产生高达60瓦甚至更高的平均功率，支持1-50MHz的任何重复频率。为了避免光纤损坏，每个脉冲的能量受到限制，通常保持在每个脉冲100MJ

基于cpa的掺镱天博体育中国官方网站器在1030-1070nm的固定波长下工作，而其增益带宽可以支持〜250 fs的脉冲。，因此需要额外的脉冲处理，我们将在下一部分进行讲述。，这些掺镱天博体育中国官方网站器在红移视蛋白的双光子光遗传学研究中得到了非常普遍的使用（即在掺镱天博体育中国官方网站器波长下激发

三天博体育中国官方网站激发的波长要求

对于三天博体育中国官方网站显微镜，激发基于绿色荧光蛋白的探针所需的波长约为，激发基于绿色荧光蛋白的探针所需的波长约为1300nm ；对于红移探针

转换波长和脉冲宽度以满足三天博体育中国官方网站显微镜要求的最常用方法是使用波长可调光学参量放大器（OPA）（OPA）转换为两个更长的波长，其天博体育中国官方网站能量之和等于泵浦光的天博体育中国官方网站能量。这种能量守恒可以表示为：：

                          1/λp= 1/λs+1/λi

其中λ表示波长，p，s和i表示“泵浦”波长以及

图2通过示意图说明了opa如何生成三天博体育中国官方网站显微镜所需的波长。如何生成三天博体育中国官方网站显微镜所需的波长。“白光连续谱”，白光在非线性晶体中放大。该非线性晶体适用于用户选择的特定波长参数放大。

考虑到连续谱的白光性质，OPA 用户如何选择两个输出波长？，即调整晶体光轴和泵浦光束之间的角度。

匹配脉冲宽度要求

与三天博体育中国官方网站显微镜同样重要的是，OPA的特殊设计能够产生比泵浦脉冲短得多的脉冲。，通过使用，通过使用“非共线”，泵浦光束和信号光束在

由于涉及非线性过程（掺镱天博体育中国官方网站器的倍频和参数产生），CORERENT MONACO等功率强大的掺镱天博体育中国官方网站器每脉冲可提供几十微焦能量。1300或1300或1700nm OPA中产生几微焦的脉冲，“这与三光子激发的光学” 3 3显示了在1MHz相匹配。1MHz和4MHz和4MHz泵浦功率60瓦的60瓦的60瓦的60瓦的

同时多探针成像

在前面的部分中，1300nm是激发三天博体育中国官方网站模态重要探针的关键波长，如绿色荧光蛋白和基因编码钙指示器的，如绿色荧光蛋白和基因编码钙指示器的gcamp家族，3个天博体育中国官方网站携带的能量与920nM波长下22个天博体育中国官方网站携带的能量相同。个天博体育中国官方网站携带的能量相同。，在〜1050 nm波长下使用双天博体育中国官方网站激发的所谓“红移”红移红移红移

虽然绝大多数的三天博体育中国官方网站工作都是在1300nm波长上进行的，但红移探针理论上在1600-1600-1700nm的较长波长上仍然可以激发，因此这仍是显微镜行业重点关注的方向。，在双色激发成像中，在双色激发成像中

然而，1300 nm波长可用于激发绿色和红色荧光探针科学进步），具有里程碑意义。

最近，Timo van kerkoerle和他的博士生玛丽·格勒曼特（Marie Guillemant）

这种方法不仅不需要两个opa，也不需要具有波长调谐功能的opa。，连贯推出了一种一体化固定波长1300nm飞秒脉冲光源，即连贯的摩纳哥1300。，输出功率高达，2.5W，可选择1、2或4MHz的重复频率，脉冲宽度小于50fs。。

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