了解2和3光子激发的天博体育源

2-和3-光子激发的好处

两光激发是一种良好的三维成像工具，现在在生命科学中广泛使用，尤其是在神经科学领域。超快（通常是飞秒）天博体育聚焦到小束腰部。该位置的高峰强度，并且只有该位置才能驱动荧光染料，蛋白质和内源性材料的两光子激发。通过在XYZ中扫描该天博体育点，可以建立一个二维图像切片或三维图像立方体，并以高信噪比和对活组织的最小热影响构建。

在追求皮层内更深的神经元映射时，在神经科学界已经获得了3片激发。大多数组织的散射和吸收特征在感兴趣的波长下提供了几个高渗透深度的窗口。高阶非线性激发还可以在组织样品中产生更牢固，更高强度的重点，从而产生干净的图像，几乎没有焦虑的荧光背景。总之，与2光子技术相比，这些3光子激发的固有特征使功能内成像深度增加了两倍。  

2-PHOTON和3光子激发在脉冲能量，波长，重复率和脉冲宽度方面，每个都有自己独特的天博体育要求。因此，基本的2-光子和3光子实验技术无法通过相同的光源来解决。本文的目的是深入探索这些特定的天博体育要求，突出显示它们如何启用每种类型的激发和呈现相应的天博体育开发，从相干来简化了2 photon和3-Photon应用程序。

2光子显微镜的天博体育要求

对生物样品的两光子激发需要短脉冲，快速光栅成像的高重复速率，与样品活力兼容的平均功率以及与许多不同可用探针的激发光谱相匹配的波长。脉冲持续时间（脉冲宽度）的需求源于由于两光子激发的概率低而需要很高的峰值功率。通常使用的脉冲持续时间在75至250 fs之间，其中较短的脉冲会导致更有效的激发，但具有更高的非线性样品甚至消除性损害的风险。

这样的短脉冲只能通过在模式锁定的制度中操作天博体育来产生。大多数模式锁定天博体育器以50-100 MHz的固定重复速率运行，这对于许多成像研究来说是一个很好的匹配。例如，考虑典型的图像大小为512 x 512像素和几个Hz的帧速率。需要在每个像素中具有多种激发脉冲以减少噪声，并且用于栅格扫描的开销需要重复率> 10 MHz。更快地扫描的实验需要10秒的MHz。 

最常用的指示器在单光子状态下激发了波长在400 nm至550 nm之间（紫罗兰色至绿光）。在两光子状态下，这大致对应于750 nm至1100 nm（近红外）之间的波长，这恰好是基于钛sapphire活动介质的可调天博体育器的完美匹配。

表1：多光子激发的最佳天博体育参数的摘要。

最后，在许多不同的研究中已经显示出，大多数样品在这些近红外波长处耐受100-200 mW的平均天博体育功率，这是足够的功率，可以通过当今的成像和功能性荧光探针来提供明亮的图像。由于某些显微镜的吞吐量低至10％，这转化为1-2瓦的天博体育功率。

如表1所述，这些要求通过单箱可调和自动化的钛sapphire（Ti：S）天博体育器很好地满足，例如Coherent的Chameleon系列。总之，据估计，全球实验室中用于两光子显微镜的这种类型的Ti：S天博体育器。

3光子显微镜的天博体育源要求

与2光子显微镜相比，3光子显微镜仍处于相对婴儿期。但是，由于它为更深的成像（例如，在神经科学中）提供了几个优势，因此其使用迅速。

天博体育需求取决于3光子事件的概率要低得多，因此，该事件的峰值功率比2光孔激发要高得多：〜100-200倍。通过使用较短的脉冲宽度和/或较高脉冲能的天博体育器可以实现较高的峰值功率。然而，当通过显微镜系统传输最短的可用模式（例如10 fs）脉冲时，分散管理（避免扭曲和拉伸的脉冲）成为一个问题。因此，将40-60 FS脉冲用于3光量激发，在高峰值和合理简单的脉冲管理之间取得了良好的平衡。 

此脉冲持续时间比2光子天博体育器的典型脉冲持续时间短〜3倍，这意味着与这些天博体育相比，我们仍然需要增加40-50 x的脉冲能量。尽管2光子显微镜天博体育器在10-40 NJ范围内具有输出脉冲能，而具有相似光学损耗的3光子显微镜将在天博体育输出处需要0.5-2 MJ。

达到此脉冲能量的一种方法是使用称为chi脉脉冲扩增或CPA的技术扩增Ti：S天博体育器的输出。 CPA是1990年代由Gerard Mourou和Donna Strickland发明的；它是如此重要且普遍使用，以至于为他们赢得了2018年诺贝尔物理奖。

ytterbium是功率缩放的关键

重复率和平均功率呢？在这里，一个主要的考虑是样本生存能力。从大量的2光量研究中得出的是，样品上的平均功率应保持在200兆瓦以下，以保持样品生存能力。在上一节中，我们指出3光子成像所需的每脉冲所需的能量应比2光子激发的情况高40-50倍。这意味着重复率必须相应降低 - 例如1-2 MHz。对于更快的成像，重复速率可以提高到4-5 MHz，但前提是当样品上每脉冲的能量按比例降低。

不幸的是，Ti：S晶体的物理特性使构建这样的天博体育不切实际。另一方面，基于ytterbium掺杂纤维的天博体育系统可以绕过这些问题。这是因为使用YB掺杂的活性纤维在更长的距离上分布了脉冲的扩增（可以盘绕纤维以产生紧凑的配置），也可以在Ti：s放大器无法实现的高重复速率上提供足够的增益。

图1示意性地说明了这种类型的YB光纤放大器的典型体系结构。与Ti：S天博体育放大器一样，第一阶段（种子天博体育+预放大器）在几十MHz的情况下会产生一系列模式锁定的脉冲。声学调节器（AOM）大门该脉冲序列并将重复率降低了整数n。参考图，如果n = 50，则在功率扩增阶段，CPA将将1 MHz脉冲序列放大。。

此体系结构极为灵活且功能尺度；它可以很容易地产生高达60瓦及以上的平均功率，并以1 MHz至50 MHz的任何重复率支持。每脉冲的能量受到光纤损伤的发作限制，通常保持在每脉冲100 MJ以下。

基于CPA的YB天博体育器以1030-1070 nm的固定波长运行，其增益带宽可以支持〜250 fs的脉冲。波长或脉冲持续时间都不与3光子显微镜直接兼容，因此如下一部分所述需要附加脉冲处理。综上所述，这些YB天博体育器在2光仪的光遗传学中变得非常流行，即带有所谓的红移OPSIN，即，在YB天博体育波长上进行兴奋，在其中使用空间光调制器在许多神经元上“传播”其高输出功率。

3光量激发的波长要求

对于3光子显微镜，基于绿色荧光蛋白激发探针所需的波长为〜1300 nm；对于红移探针，它是〜1700 nm。在这两种波长状态中，1300 nm被证明是更有益的3光量成像“窗口”，这一点将在本文后面阐述。  另外，有效的3光子激发还需要40-60 Fs的脉冲宽度。那么，我们如何使用YB天博体育器获得这种性能？

转换波长和脉冲宽度以满足3光子显微镜要求的最流行方法是使用可波长 - 可触发光学参数测定器（OPA）。该设备将泵波长（从YB天博体育器）转换为两个更长的波长，其光子能量之和等于泵光的光子能量。  这种能量保存可以表示为：

                          1/λp= 1/λs+1/λi

其中λ表示波长，p，s和我确定了“泵”波长以及OPA产生的两个波长，通常称为“信号”和“ iDler”波长。出于历史原因，惰轮始终是两个波长的较短。

图2通过示意性地说明了OPA如何生成3光子显微镜的必要波长。 YB天博体育输出的一小部分用于在薄板中产生宽带“白光连续体”。然后，白光在适用于用户选择的特定波长的非线性晶体中放大。 YB天博体育输出的其余部分频率加倍，以在515-520 nm处创建绿灯，这是OPA的“泵”波长。  通过这种布置，OPA可以产生1300 nm的惰波长，该波长与流行的“绿色”探针的3光量激发相匹配。节能要求信号波长为860 nm。

给定连续体的白光性质，OPA用户如何选择两个输出波长？这是通过相匹配来实现的，即调整晶体和泵束光轴之间的角度。通过倾斜晶体，可以选择来自白光的一对波长。可调的OPA具有手动或电动和计算机控制的阶段，以简化选择信号波长的选择。

匹配脉冲宽度要求

对于3光子显微镜同样重要，OPA的特定设计使得产生比泵脉冲短得多的脉冲。具体而言，通过使用“非连续性”设计，其中泵束和信号梁以OPA晶体的不同角度传播，可以产生短至20-25 fs的脉冲i。这种非连线方法在调谐范围内留下约300 nm的间隙，通常在940和1250 nm之间。幸运的是，该区域与3光量激发无关。

由于涉及的非线性过程（YB天博体育和参数生成的频率加倍），总体系统效率相对较低。那就是YB天博体育器的功率扩展所得到的。像连贯的摩纳哥这样强大的YB天博体育器每脉冲几十µj。这可以从1300或1700 nm处的OPA每脉冲中获得几µj，这与光学“窗口”相匹配，以进行3光孔激发。图3显示了一个典型的OPA（相干opera-f）的典型调整曲线，该曲线在1和4 MHz时泵送60瓦，这是许多研究组使用的设置。

同时多探针成像

在先前的部分中，我们将1300 nm作为在3光片模态中激发的关键波长重要的探针，例如绿色荧光蛋白（绿色荧光蛋白）和遗传编码的钙指示剂的GCAMP家族，其中3个光子在920 nm时具有与2个光子相同的能量。同样，使用2光子激发在〜1050 nm激发的所谓“红移”探针可以以1600-1700 nm的3光量模态激发。这些探针包括M-Fruit形态探针和RCAMP钙探针 - 另请参见图4

虽然在1300 nm进行了绝大多数3光子工作，但在1600-1700 nm的较长波长中使用红移探针概念可兴奋，仍然对显微镜社区感兴趣。这似乎表明理想的3光子天博体育器应该能够产生两个波长，甚至可能同时进行两色激发成像。由于组织散射较低，较长的波长具有更深的成像，尽管吸水率在1700 nm时高于1300 nm，这意味着样品热损伤的可能性更高。

但是，几项已发表的研究表明，1300 nm可用于激发绿色和红色荧光探针，或者至少有许多。然后使用波长选择性过滤器轻松分离两个探针的荧光发射。例如，在2021年，克里斯·徐（Chris Xu）发表了一篇关于多色荧光团的单波长3p激发（多色三光子荧光成像，具有单波长激发在小鼠脑中的深度）的文章。 

最近，蒂莫·范·克科尔（Timo Van Kerkoerle）和他的博士学位。学生Marie Guillemant在小鼠前额叶皮层中同时激发了与右旋烷和TDTOMATO标记的小鼠中间神经元，并通过3P激发使用3P兴奋，并调谐到1300 nm（图5）。图4中的Z-stack图像显示了从红移探针向下至〜1 mm深度的显着信号。

这种方法不仅消除了对两个OPA的需求，而且还消除了对波长调谐的OPA的需求。为了更轻松地实现这种多探针方法，Coherent引入了一个单箱，固定的波长源为1300 nm femtsecond脉冲，称为连贯的摩纳哥1300。这种紧凑的源是一种完全集成的免提天博体育器，输出功率高达2.5 w，选择1、2或4 MHz重复率，脉冲宽度<50 fs。所有这些参数都是深3光子成像的理想匹配，因此连贯的摩纳哥1300是第一个专门针对3光子显微镜的单箱，键源。 

认识到3片成像的出现和增加的流行度，连贯的摩纳哥1300的设计结合了用户效果，这些用户效果是2片显微镜的最先进天博体育的一部分，例如coherent变色龙发现和Axon。实际上，单箱中的连贯摩纳哥1300功能总功率控制（TPC）选项提供了直通电源衰减/门控，以及紧凑型脉冲压缩机（CPC）选项，可提供任何类型的显微镜设置，可在样品上提供分散脉冲预先计算，以提供最佳的脉冲宽度。