白皮书
天博体育中国官方网站 在非线性天博体育中国官方网站镜内的峰值功率：无夸大成分
多光子激发（MPE）显微镜将飞秒激光器引入生物研究实验室已有20多年的历史。各种探针的激发所需的波长范围以及与低损伤体内成像兼容的激光功率已经基本确定成型。然而，合适的天博体育中国官方网站宽度仍然是讨论的主题、影响着个人操作偏好，以及不同的实验条件下的变化。本白皮书提供了有关非线性成像应用的飞秒天博体育中国官方网站传输和管理的有用信息。
简介
由于denk等人在双光子激光扫描荧光天博体育中国官方网站镜中的开创性成就，非线性成像和专用超快激光器的采用和结合已被大大扩展[1]。同时，激光技术的能力、可用性和灵活性也显着增长。
最初的工作以复杂的染料天博体育中国官方网站器技术为主，而现在钛宝石（ ti：s）天博体育中国官方网站器、光纤天博体育中国官方网站器和 opo系统以交钥匙形式提供了大量选项，对于非天博体育中国官方网站专家来说也很容易使用。
选择用于多光子荧光激发或光激活的天博体育中国官方网站技术时，需要考虑许多关键的技术因素。选择特定波长或波长范围是一个相对简单的过程
造成这种困难的原因有很多，主要是因为样品损伤和荧光强度之间的相互作用，另一方面是平均功率、峰值功率和波长之间的相互作用。使问题进一步复杂化的是，在文献中可以发现，MPE的波长为680至1,300nm，1,300 nm，天博体育中国官方网站为5fs至1-2ps，在样品处的天博体育中国官方网站能量为数十皮焦耳至微焦耳。此外，在样品处的天博体育中国官方网站能量为数十皮焦耳至微焦耳。此外，现代激光器能够通过对显微镜系统光学系统中的线性色散进行预补偿，将较短的天博体育中国官方网站输送到样品平面上。因此，将较短的天博体育中国官方网站输送到样品平面上。因此
背景：非天博体育中国官方网站荧光激发
我们首先假设读者具有知晓生物样品多光子激发原理和优点的基本知识。可以说，对于单个天博体育中国官方网站
激光天博体育中国官方网站的峰值功率虽然严格取决于精确的时间轮廓天博体育中国官方网站，但通常写成：
其中，激光器的天博体育中国官方网站能量为：
PAV为激光的平均功率，f代表天博体育中国官方网站重复频率，tP代表fwhm天博体育中国官方网站持续时间。
对于激光扫描天博体育中国官方网站镜，被激发的探针具有相对较短的荧光寿命
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从这里可以相对简单地看出可以调整哪些天博体育中国官方网站参数来增加样品的荧光。问题是，并非所有这些参数都可以在不影响样品可行性、技术可用性和/或成本的情况下自由调整。现在将单独探讨这些参数的权衡问题。
多光子天博体育中国官方网站成像的光损伤
尽管有许多关于共焦成像中光毒性和天博体育中国官方网站光损伤的参考文献和论文，但探索体内和体外mpe方法和样品类型的这些动力学的针对性、系统性和定量研究仍然相对较少。
一些出色的见解和背景可以参考地狱等。 [2]和koenig [3]。本节的大部分讨论源自地狱[2]，活塞[4] 、Neher [5]领导的小组的关键工作中使用的典型平均天博体育中国官方网站（焦平面上 〜100 mw）决定了温度升高<1°C，并得出结论，在这些样品中，由于mpe所需的激光天博体育中国官方网站而引起的热损伤不是问题。然而，重要的是要认识到
光漂白是一种由于荧光物质本身的降解而导致天博体育中国官方网站荧光发射快速减少的机制。通常，光损伤这个词被用来表示光漂白是光诱导损伤的主要原因O将其能量转移到单线态氧态。
与天博体育中国官方网站间交叉的概率无关
总而言之，增加生物样本上的激光功率最终会导致光损伤，这种损伤可以是线性的（被水和其他成分吸收）和非线性的（2p吸收导致额外的1个或更多光子吸收，从而导致光漂白，从而导致光漂白）。Mpe显微镜中的热损伤可以通过减少天博体育中国官方网站持续时间（因此减少平均功率）
损坏还取决于波长。大量研究表明，激发波长从700-800nm增加到900-1,100nm甚至1,250nm有利于样品的生存力。当然，并非所有探针都天博体育中国官方网站用长波长激发更安全的920-1,100 天博体育中国官方网站区域激发的探针。
虽然对较长波长的评估似乎是一致的，但理想天博体育中国官方网站持续时间的选择仍然更加主观，甚至是基本意识形态。在进一步讨论之前，回顾一下显微镜系统中短天博体育中国官方网站的管理非常有益。
图1：通过高阶非天博体育中国官方网站相互作用的光漂白机制，改编自[7]
管理飞秒天博体育中国官方网站的传输
特定时间fwhm宽度的超快激光天博体育中国官方网站具有固有的最小频率带宽，由其时间天博体育中国官方网站形状控制。对于商用ti：s激光器典型的超割线形天博体育中国官方网站（Sech2）
或者用天博体育中国官方网站来表示：
时间带宽积为0.315 sech2天博体育中国官方网站称为变换受限天博体育中国官方网站。例如，800 nm 、100 fs天博体育中国官方网站的带宽为6.725nm。实际上，完美的天博体育中国官方网站很难实现
天博体育中国官方网站宽度越短，带宽就越大。这很重要，因为宽带宽天博体育中国官方网站在通过复杂的光学系统（例如多光子显微镜）时会表现出一种称为群延迟色散（ gdd）的现象。由于光学材料对不同波长的折射率不同
Chameleon Xr），其运行天博体育中国官方网站持续时间围绕显微镜系统的典型gdd定制
图2：针对不同输入天博体育中国官方网站持续时间和显微镜复杂性的天博体育中国官方网站展宽。它演示了约140fs的天博体育中国官方网站如何在最广泛的条件下向样品提供最短的天博体育中国官方网站。
天博体育中国官方网站镜系统的gdd强烈依赖于波长，并且在较短波长下通常比在超过1000nm的波长下高得多。系统的总gdd gdd gdd gvd （群速度色散）
对于超过1050nm的波长，中等复杂的显微镜的总gdd低于8000fs2，因此除了最短的天博体育中国官方网站之外
图3：适用于商用2p天博体育中国官方网站镜中典型光学材料的gvd
飞秒天博体育中国官方网站器中gdd的预补偿
从图2清楚地表明，当总gdd远高于8000fs2时，采样平面处的天博体育中国官方网站宽度如何在天博体育中国官方网站小于120fs 时急剧增加。当显微镜系统中包含调制器（ aom或eom（eom），时
为了避免这种影响，熟练的最终用户和激光公司成功地设计了对二阶gdd进行预补偿的方法，即在输入光学系统之前向天博体育中国官方网站添加负啁啾[10]。这会对图像亮度产生显着影响
只要所使用的波长固定并且负啁啾的数量或变化受到限制，gdd预补偿的实际实现就可以使用啁啾镜[11]来完成。然而，典型的商用可调谐ti：s天博体育中国官方网站系统现在可提供基于棱镜对压缩器的色散补偿[12]。该系统可以通过棱镜平台的机动化实现完全自动化。
如图5所示
动态改变天博体育中国官方网站宽度的能力可以带来好处，包括最大化峰值功率
图4：通过色散补偿增加图像亮度的示例。激光天博体育中国官方网站和检测增益保持恒定，但
图5:色散补偿ti：s天博体育中国官方网站器的负gdd曲线。蓝线以下的任何值都可以编程为自定义的用户曲线。
选择带或不带色散补偿的天博体育中国官方网站器时需要考虑实际情况。考虑因素包括：
- 天博体育中国官方网站器更复杂、体积更大。基于棱镜的压缩器为天博体育中国官方网站输出增加了至少2-3米的光路长度，尽管光束折叠工程设计精巧，但预补偿部分通常会增加约30
- 棱镜本身也会给光束增加一定量的波前畸变
- 通过棱镜的时候会存在一些传输损耗。通常效率在80％到90％之间，具体取决于波长。对于需要非常高平均天博体育中国官方网站的应用来说，这可能是一个重要的考虑因素。
- 为特定的显微镜配置设置正确的曲线非常重要；否则，可能会无意中向样品传递更长而不是更短的天博体育中国官方网站。
一般来说，<<100 fs的激光器将受益于除了最简单的光学传输系统之外的所有色散补偿。事实上，这类激光器就需要如此。对于天博体育中国官方网站约为140fs的激光器，其好处可能并不总是超过预补偿功能带来的额外成本和尺寸的影响。然而，它可能会为各种样品类型带来更大的使用灵活性。
如果选择具有色散补偿和70-80fs量级的极短天博体育中国官方网站的ti：s激光器
图6:典型ti：s激光天博体育中国官方网站的Gddgdd gdd，以确保优异的性能。
多短才算太短？
考虑到具有自动色散补偿的ti：s激光器在市场上的成功，人们可能会问为什么不使激光天博体育中国官方网站尽可能短？有一些重要的限制因素，共
在可调谐激光器的范围内，光学设计的局限性意味着需要在平均功率和调谐范围之间进行权衡。例如，140 fs的Ti：s激光器可以从680nm调谐到1080nm调谐到1080nm。一个75fs的天博体育中国官方网站，由于其固有的更宽的带宽
在成像荧光标记的背景下还应着重非常短天博体育中国官方网站的更宽带宽。双光子横截面虽然通常比单光子横截面宽，但通常小于，但通常小于100nm，此外，横截面可能取决于实际天博体育中国官方网站宽度[13，14]。超宽带天博体育中国官方网站更常用于同时激发多个探针
到目前为止，色散讨论仅集中于二阶色散效应。对于更复杂的显微镜系统上的超宽带宽天博体育中国官方网站
总结
几乎所有普遍关注的非线性显微镜应用，包括体内神经科学的光遗传学和生理学，50-200 fs 范围内的飞秒天博体育中国官方网站（来自激光源）来解决。产生低于