天博体育中国官方网站 在体外细胞内的极高功率：无夸大成分
多光子激发（MPE）实验室将飞秒激光器引入生物研究已有20多年的历史。各种刺激的所需的波长范围以及与低损伤强度兼容的激光功率已经基本确定配制。然而，合适的天博体育中国官方网站宽度仍然是讨论的主题、影响着个人操作偏好，以及不同的实验条件下的变化。本端口提供了有关近红外应用的飞秒天博体育中国官方网站传输和管理的有用信息。
简介
得益于Denk等人在双光子激光扫描荧光显微镜中的初步性成就，非线性成像和专用超快激光器的应用并结合已得到了极大的扩展[1]。同时，激光技术的能力、可用性和灵活性也显着增长。
最初的工作以复杂的染料激光器技术为主，而现在钛宝石（Ti:S）激光器、光纤激光器和OPO系统以交钥匙形式提供了大量选项，对于非激光专家来说也很容易使用。
选择用于多光子荧光激发或光激活的激光技术时，需要考虑许多关键的技术因素。选择特定波长或波长范围是一个相对简单的过程，由相关荧光标记的有据可查的图形光谱驱动。更困难的是选择最优功率或最高功率状态。
造成这种困难的原因有很多，主要是因为载荷损伤和荧光强度之间的响应，另外是平均功率、最高功率和波长之间的响应。使问题进一步复杂化，在文献中可以发现，MPE的波长为680至1,300 nm，脉冲为5 fs至1-2 ps，在样品处的脉冲能量为干皮焦耳至微焦耳。另外，现代激光器能够通过对真空系统光学系统中的线性天博体育中国官方网站进行预补偿，将诱导的脉冲到真空样品平面上。在选择中存在一些模糊和个人偏好的空间，这通常是由过去的经验决定的，这些经验可能适用于也可能用于独立新的实验。本最终的目标是根据相干变色龙系列的应用中获取的数据，来提供一些相关的指南。
背景：非单色激发
我们首先假设读者光子具有生物样品多光子激发原理和优点的基本知识。可以说，对于单个天博体育中国官方网站，瞬间功率激励，吸收2个（或更多）光子的概率就越大。随之而来的是随之而来的是会有更多的荧光激发，更多的发射可用于检测。
激光天博体育中国官方网站的峰值功率虽然严格依赖于精确时间的天博体育中国官方网站，但通常写成：
其中，激光器的天博体育中国官方网站能量为：
Pav为激光的平均功率，F 代表天博体育中国官方网站重复频率，TP代表FWHM天博体育中国官方网站持续时间。
对于激光扫描显微镜，被激发的具有激光器相对湿度的荧光消耗，时间平均发射也取决于这些天博体育中国官方网站输入到样品的速率。因此，总荧光捕获率可以写为激光器的时间平均功率和峰值功率的乘积，如下：
用商业激光系统数据表中常见的参数来表示这一点是有利的，例如平均功率、天博体育中国官方网站宽度和重复频率。因此：
从这里可以比较简单地看出可以调整哪些激光参数来增加溶液的荧光剂。问题是，并非所有这些参数都可以在不影响呼吸、技术可用性和/成本或成本的情况下自由调整。现在将单独探讨这些参数的权衡问题。
多光子显微成像的光损伤
尽管有许多关于共焦推断中光毒性和线性光损伤的参考文献和论文，但探索体内和体外 MPE 方法和样品类型的这些动力学的稳态、系统性和定量研究仍然相对较少。
一些出色的意见和背景可以参考 Hell 等人。 [2] 和 Koenig [3]。本节的大部分讨论了地狱 [2]、Piston [4]、Neher [5] 领导小组的关键工作，以及 Cheng 等人 [6,7]光漂白机制的理论分析。激光损伤的一个公认原因是光热响应。通过超快激光源或任何其他连续波或天博体育中国官方网站激光源的基本波长的线性吸收而发生。线性吸收高度依赖于样品类型和所使用的波长，但仅与样品吸收的平均功率相关，而与瞬时感功率无关。例如，在大多数生物样品中占主导地位的水，在近红外光吸收具有特定的吸收谱线，一般来说，当使用1350 nm以上的波长时，其吸收变得更加显着。对样品的影响包括局部加热，并最终使样品中的水沸腾，从而导致空化。然而，应该注意的是，损坏可能在空化之前发生，即当局部温度升高超过细胞活力的短暂时。地狱等人[8]对仅通过线性吸水率确定的样品温度升高进行了简单但令人信服的评估。表明，MPE中使用的典型功率（焦平面上〜100） mW）决定了温度升高< 1°C，并得出结论，在这些样品中，由于MPE所需的激光功率而引起的热损伤不是问题。然而，重要的是要认识到，在血红蛋白或黑色素等其他物质存在强吸收的情况下，样品温度可能会逐渐上升。例如，在人体皮肤中，2P光同样受到黑色素吸收的限制[9]。在仅存在线性效应的情况下，可以通过减少天博体育中国官方网站时间并增加有利于非线性持续的剧烈功率来最小化这些效应。
光漂白是一种由于荧光物质本身的降解而导致乳液荧光机制发射迅速减少的发生。通常，光损伤这个词被用来表示光漂白是光损伤的主要原因，尽管从长来看可能还有其他发生机制。这些机制可能是由与光漂白相关的化学变化触发的，但光漂白本身的时间可能比（几或几十秒）更长。光漂白的机制很复杂，在各个领域的机制都被积极地研究。虽然光漂白在单光子和双光子激发下都会发生，但在双光子激发的情况下，仅限于焦平面。已经到了认识，在飞秒人们存在天博体育中国官方网站的情况下，光漂白可能会随之产生动力2而增加，双光子和三光子过程的混合，甚至更高阶的过程[4, 5]。图1显示了对光漂白的相对固有的简单解释。这里，染料（或荧光染料）分子通过双光子吸收被激发到第一单线态S1；与额外光子的相应通过kb过程将分子激发到更高的状态，可能导致分子解离。或者，单线态激发可以通过系间窜越转移到三线态T1，并且该状态可以通过ko将其能量转移至单线态氧态。
与系统间交叉的概率相关，很明显，MPE中增加的光子光子，特别是在高功率情况下，将增加三或四个光子应答的概率，从而导致高度非线性项。
总而言之，增加生物样本上的激光功率最终会导致光损伤，这种损伤可能是线性的（被水和其他成分吸收）和非线性的（2P吸收导致额外的1个或更多光子吸收，从而导致光漂白）。MPE细胞器中的热损伤可以通过减少天博体育中国官方网站持续时间（减少平均功率）来减少，但由此产生的峰值功率增加可能会导致更高的间接光斑或其他形式的损伤。那么，必须在热损伤的减少和间接效应发生之间进行权衡。
损坏还取决于波长。研究表明，激发波长从700-800 nm增加到900-1,100 nm甚至1,250 nm有瞬间促进的生存力。当然，并不是所有的亮点都可以用长波长激发，但只有可能，在激发光谱的红色易激发荧光团似乎是有利的。这也是有用的，因为因此的波长出现了明亮的光线，也有利于红外线的成像。更好，更长的波长更不受天博体育中国官方网站的影响，这将在下一节中讨论。所有这些因素都促进MPE可以采用在更安全的920 - 1,100 nm 区域激发的探针。
虽然对黑洞波长的评估似乎是一致的，但理想天博体育中国官方网站持续时间的选择仍然更加引人注目，甚至是基本的一个。在进一步讨论之前，回顾一下黑洞系统中短天博体育中国官方网站的管理非常有价值。
图1：通过高阶对话的光漂白机制，改编自[7]
管理飞秒天博体育中国官方网站的传输
特定时间FWHM宽度的超快激光天博体育中国官方网站具有一定的最小频率带宽，由其时间波形天博体育中国官方网站控制。对于Ti:S激光器典型的超割线形天博体育中国官方网站（sech2），见下式：
或者用波长来表示：
时间带宽积为 0.315 的 Sech2天博体育中国官方网站调用转变架构天博体育中国官方网站。例如，变换的800 nm、100 fs天博体育中国官方网站的带宽为6.725 nm。实际上，完美的天博体育中国官方网站限制很难实现，对于Ti:S激光器，带宽通常会变换带宽的1.1-1.3倍。
脉冲宽度越短，带宽就越大。很重要，因为宽带脉冲在通过复杂的光学系统（例如多光子激光器）时会表现出一种称为群延迟天博体育中国官方网站（GDD）的现象。由于光学材料对不同波长的比重不同，这种二阶效应意味着光谱的红色部分比蓝色部分快速地跨越了光纤，从而有效地延长了脉冲。这种脉冲被称为正啁波长。脉冲的带宽增量，脉冲的长度长。
第一代专为多光子显微成像设计的自动化激光器（Chameleon XR），运行天博体育中国官方网站持续时间围绕子系统的典型GDD定制，包括复杂的物镜、调制器和一些其他反射元件。图2说明了约140 fs的天博体育中国官方网站宽度其如何接近各个子系统GDD的最优值。
图2：针对不同输入天博体育中国官方网站持续时间和子复杂性的天博体育中国官方网站展宽。它演示了约 140 fs 的天博体育中国官方网站如何在最广泛的条件下向样品提供最短的天博体育中国官方网站。
呼吸系统的 GDD 强烈依赖于波长，并且在波长下通常比在超过 1000 nm 的波长下高倍数。系统的总 GDD 是 GVD（群速度天博体育中国官方网站）与材料长度的乘积。典型的 GVD 数据如图 3。请注意 TeO2 的高效应，TeO2 是声光调制器中最常用的材料。
对于超过1050 nm的波长，中等复杂细胞的总GDD低于8000 fs2，因此除去最短的天博体育中国官方网站距离，天博体育中国官方网站展宽并不是所有天博体育中国官方网站的重点关注点。事实上，在这种条件下，1100 m处200 fs的天博体育中国官方网站宽度已经延伸到约230 fs。
图3：适用于2P显微镜中典型光学材料的GVD。
飞秒激光器中GDD的预补偿
从图 2 清楚地表明，当总 GDD 远超过 8000 fs2 时，采样平面处的天博体育中国官方网站宽度如何在天博体育中国官方网站小于 120 fs 时即将增加。当工作站系统中包含调制器（AOM 或 EOM）时，这种情况很常见，这是大多数 MPE 工作站的常见做法。
为了避免这种影响，破解的用户和激光公司成功地设计了对二阶GDD进行预补偿的方法，即在输入光学系统之前向天博体育中国官方网站添加负啁鸣[10]。为了使这幅图像产生明显的影响，同时保持平均激光功率稳定，如图4所示。
只要使用的波长固定且负啁啾的数量或变化受到限制，GDD预补偿的实际实现就可以使用啁啾镜[11]来完成。然而，典型的可旋转Ti:S激光系统现在可以提供基于棱镜对压缩器的天博体育中国官方网站补偿[12]。该系统可以通过棱镜平台的机械化实现完全自动化。
如图5所示，用户可以设置适合特定其细胞的GDD曲线，这样对于任何选定的波长，样品平面上的天博体育中国官方网站宽度都可以最小化。
动态改变天博体育中国官方网站宽度的可以带来好处，包括提高功率，并且在某些情况下，当担心光毒性造成损害时，可能需要增加天博体育中国官方网站宽度。研究表明，啁鸣（即拉伸能力）可以是最大限度减少此类损害的有效方法[2]。
图4：通过天博体育中国官方网站补偿增加图像亮度的夜晚。激光功率和检测增益保持恒定，但A的GDD设置不同：0 fs2、B:10000 fs2 和 C:15000 fs2.CY3 标记神经细胞的840 nm推理由格勒诺神经布尔科学研究所提供。
图5：天博体育中国官方网站补偿Ti:S激光器的负GDD曲线。蓝线以下的任何值都可以编程为自定义的用户曲线。
选择带或不带天博体育中国官方网站补偿的激光器时需要考虑实际情况。考虑因素包括：
- 激光器更复杂、体积更大。基于棱镜的压缩器为输出激光增加了至少2-3米的光路长度，光束折叠工程设计精巧，但预补偿部分通常会增加约30厘米的激光长度。
- 棱镜本身给光束增加了一定量的波前畸变，这反过来又导致光束增加像散。这可能会影响图像的点扩散函数。激光构建过程和设计的最优化实践也弥补了这种影响。
- 通过棱镜的时候会存在一些传输损耗。通常效率在 80% 到 90% 之间，具体取决于波长。对于需要非常高平均功率的应用来说，这可能是一个重要的考虑因素。
- 对于特定的实验室配置设置正确的曲线非常重要；否则，可能会无意中向样品输入更长的时间而不是更短的天博体育中国官方网站。
一般来说，脉冲 <100 fs 的激光器将受益于除了最简单的光学传输系统之外的所有天博体育中国官方网站补偿。事实上，这类激光器就需要如此。对于脉冲大约 140 fs 的激光器，其好处可能并不总是超过预补偿功能带来的额外成本和尺寸的影响。然而，它可能会为各种样品类型带来更大的使用灵活性。
如果选择带有天博体育中国官方网站补偿和70-80 fs量级的极短脉冲的Ti:S激光器，则预补偿棱镜的正确的处理关键。如图6所示，可能需要更规则地进行适当的激光操作和优化。
图6：典型Ti:S激光天博体育中国官方网站的GDD设置为复位。启动的天博体育中国官方网站需要仔细地设置GDD，以确保优异的性能。
多短才算太短？
考虑到具有自动天博体育中国官方网站补偿的 Ti:S 激光器，人们在市场上取得成功时，可能会问为什么不使激光脉冲脉冲短？有一些重要的限制因素共同限制了此类风险尝试。
在可调谐激光器的范围内，光学设计的约束意味着需要在平均功率和聚焦范围之间进行权衡。例如，140 fs 的 Ti:S 激光器可以从 680 nm 聚焦到 1080 nm。一个 75 fs 的天博体育中国官方网站，由于其固有的较宽的带宽，不能聚焦如此接近 Ti:S 荧光发射光谱的边缘，因此被限制在 ~ 1050 nm。这对于想要对 mCherry 等红色荧光蛋白进行成像的用户来说非常重要。另外，当激光光谱超过 100 nm 时，其形状往往会极度平滑的高斯分布，导致某些光谱的实际激发效果不佳。
在成像荧光标记的背景下还应着重非常短天博体育中国官方网站的更宽带宽。双光子横截面虽然通常比单光子横截面宽，但通常小于 100 nm，此外，横截面可能取决于实际天博体育中国官方网站宽度 [13, 14]。超宽带天博体育中国官方网站更常用于同时激发多个探针，而不是处理单个标记。可能的例外是谐波显微成像中，相位匹配相对与波长无关，或者是量子点的激发的时候，因为这些探针显示的是数百纳米的带宽。在这些情况下，使用非常短的天博体育中国官方网站会产生高信号，然而，MPE 中仅偶尔采用低于 50 fs 的天博体育中国官方网站。
其中，天博体育中国官方网站讨论仅集中于二阶天博体育中国官方网站效应。对于更复杂的细胞系统上的超宽带宽脉冲，三阶天博体育中国官方网站（TOD）也可能是一个考虑因素。这是对GDD的频率驱动，以fs3为单位表示。TOD比GDD更难建模，并且不能单独使用棱镜进行预补偿。对这种效应的讨论超出了我们当前的目的，但作为一般指南，脉冲方案30 fs 或多个（或具有相当带宽的脉冲）的激光器将需要更复杂的系统来对脉冲进行相位控制，以实现高效的多光子激发[15]。
总结
几乎所有普遍关注的民间手术应用，体内神经科学的光联想和生理学，都可以使用50-200 fs范围内的飞秒脉冲（来自激光源）来解决。产生低于~100 fs脉冲的激光源受预补偿的使用，造成由于电力恢复而导致损失。在1微米以上的宽度处，对预补偿的需求不太严重，因为所有光学材料的GDD在其波长的波长处都会出现下降。与所用的波长无关，平均功率和/或峰值功率的增加最终会分别导致线性（热）或非线性损坏。两种类型的损坏之间存在权衡，但不同样品之间有所不同，而且还随波长而变化。还取决于实验观察的时间测量。一般来说，在平板样品中获得较高的功率，增加了在具有高线性吸收的样品中激发了更多荧光的能力和灵活性，但同时因此也更容易受到热损伤。此外，对于使用高天博体育中国官方网站光学显微镜的用户来说，增加了GDD 预增加补偿将在图像亮度方面带来好处，这很可能证明激光器的成本和复杂性是合理的。