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非线形天博综合app官网登录におけるピークパワー：retorikkuの解明

マルチfoton励起（MPE）天博综合app官网登录法は、20年以上にわたってfuェムト秒reーザを生物学研究室に导入してきました。低ダメージの生体内イメージngと互换性のある、さまざまなプローブの励起に必要な波长范囲およびreーザ出力は十分に确立されています。ただし、适切なパルス幅は依然として议论の対象であり、个人の嗜好やさまざまな実験条件によって异なります。このホワイトペーパーでは、非线形イメージnguapurikeshon用のufェムト秒パルス伝播と管理に关する有用な情报を提供します。

はじめに

Denkらによる2光子reーザ走查型蛍光天博综合app官网登录の先駆的な业以来成绩、非线形イメージngグと専用のウルトラァーストーザの采用は大きく広がっています[1]。同时に、reneザ技术の机能、使いやすさ、柔软性も大大に向上しました。

少年の研究は复雑な色素reーザ技术が主流でしたが、现在はreーザの専门家でなくても简単に使使用できるターンキー形式で、チタンサfuァイareーザ、ァイバーreーザ、OPOSushisutemuの豊富なオプションが使用できます。

多光子蛍光励起または光活性化用のoreーザ技术を选択する际には、な技术的考虑がいくつかあります。特定の波长重要（または波长范囲）を选択することは、対象となる蛍光プローブの励起断面ペクトルが十分に文书化されていることで促进される、比较的简単なプロセスです。より难しいのは、最适な出力やピークパワー领域の选択です。

この困难にはいくつかの理由がありますが、その主な理由は、双方では试料のダメージと蛍光强度であり、他方では平均出力、ピークパワー、波长の应对です。さらに问题を复雑にしているのは、文献では、マルチfoton励起（MPE）は波长680～1,300 nm、パルsu5 fs～1～2 ps、试料でのエネルギー/パルスは困ピコジュール～マイクロジュールで実施されていることです。さらに、最新のoreーザは、天博综合app官网登录シテムの光学系における线形分散を前置补偿することにより、このような短パルスを试料面に正确に稀疏す结果として、选択にはある程度の暧昧さや个人の嗜好が入る余地があり、多くの场合、过去の経験によって决まり、それが新しい実験に当てはまるかどうかはわかりません。このホワイトペーパーの目的は、连贯变色龙福ァミ里ーに关连するeapurikeshonから得られたデータポイントに基づいて、いくつかのガイドラインを提供することです。

背景：非线形蛍光励起

ここではまず、読者が生物试料の多光子励起の原理と利点について基本的な知识を持っていることを前提とします。つまり、単一パルスの场合、瞬时ピークパワーが高いほど、2光子（またはそれ以上）吸收の正确率が高くなります。その结果、蛍光励起がより多くなり、検出に利用できる発光がより多くなります。

reーザパルsuのピークパワーは、正确的时间プロァイルパルスに厳密に依存しますが、一般に次のように记述されます。

ここで、reーザのパrusuエネルギーは次のとおりです。

P_avはreーザの平均出力、Fはパルsu缲り返し周波数、T_PはFWHMパルsu幅をそれぞれ表します。

reーザ走查型天博综合app官网登录の场合、励起されるプローブの蛍光消耗者が比较的短いため、时间平均発光は、パrusuが试料に达到する速度にも依存します。この目的を达成するために、総蛍光收量は、次のようにーザの时间平均出力とピークパワーの积として次のように表すことができます。

これを、平均出力、パルsu幅、缲り返し周波数など、市贩のreーザシステムのデータシートに记载されているパラメータで表すと役立ちます。结果：

平均功率脉冲宽度-天博综合app官网登录p-rate-formula-4.jpg

ここから、试料からの蛍光を増やすためにどのoreーザパラメータを调整できるかを确认するのは比较的简単です。问题は、试料の生存能力力、技术的有用性、コsutoo犠牲にすることなく、これらのパラメータすべてを自由に调整できるわけではないことです。これらのトreードオfuを个别に検讨します。

マルチfoton天博综合app官网登录における光ダメージ

共焦点イメージngグにおける光毒性と线形光ダメージに关する多くの文献や论文があるにもかかわらず、生体内および外部のMPE法と试料の种类を対象とした、これらの动态に关系する系统的かつ概念的な研究はまだ比较的少数です。

地狱ら [2] とKoenig [3] から、いくつかの优れた洞察と背景を得ることができます。このセクションの议论の大部分は、地狱[2]、活塞[4]、Neher [5]を中心とするグループによる主要な研究と、成らによる光白化メカカズムの理论的解析 [6、7]に基づいています。reーザダメージの原因として确认されているのは、光热应答です。これは、ウルトラァーsutoreーザ光源、またはその他のCWreーザ光源やパルス発振雷ーザ光源の基本波长の线吸收によって起こります。线吸收は试料の种类と使用する波长に大きく依存しますが、试料が关系吸收する平均出力にのみし、瞬间的なピークパワーには关系しません。たとえば、ほとんどの生体试料の大部分を占める水は、近赤外域に特异的な吸收线を持っており、一般的に1350 nm以上の波长を使用すると、その吸收が顕着になります。试料へのとしては、局所的な加热があり、最终的には试料内の水が加热してキャビテーションが発生します。しかし、キャビテーションが発生するかなり前、つまり局所的な温度上升が细胞の生存可能性の极限界を超えた时点でダメージが発生する可能性があることに注意する必要があります。地狱ら[8]は、线形吸水率のみによって决定される试験片の温度上升について、単纯だが说得力のある评価を行いました。彼らは、MPEで使用される典型的な平均出力（焦点面积で～100） mW）が1°C未満の温度上升をすることを示し、これらの试料ではMPEに必要なreーザ出力による热ダメージは问题ではないと结论付けました。ただし、ヘモグロビンやメラninnoような他の化学种による强い吸收が存在する场合、试料の温度はより剧的に上升する可能性があることを认识することが重要です。たとえば、人の皮肤では、2P光透过はメランの吸收によって制限されることがよくあります[9]。线形效果のみが存在する场合は、パルsu幅を短くし、非线形励起に有效なピークパワーを増加させることで、これらの影响を最小限に抑制えることができます。

光退色は、蛍光种自体の劣化により试料の蛍光発光が急速に减少するメカズムです。多くの场合、光ダメージという言葉は、光によるダメージの主な原因として光退色を示すために使われますが、より长期的に起こるメカニズムは他にもある可能性があります。これらのメカニズムは、光退色に关连する化学変化によって引き起こされる可能性がありますが、光退色自体のタイムsukeru（数秒）から预约秒）よりも长い时间にわたって起こる可能性があります。光退色のメカズムは复雑で、様々な侧面から活発に研究されています。光退色は1光子励起と2光子励起の両方で起こりますが、2光子励起の场合は焦点面に限定されます。fuェムto秒パルスがする场合、光退色は2以上の出力で増存在加することが知られており、これは2光子と3光子の混合プロセsu、またはさらに高次のプロプロセsuであることを示しています[4、5]。光退色におけるより高い非线形性の简単な说明を図1に示します。ここでは、色素（または蛍）光タンパク质）分子は、2光子吸收によって最初の一重项状态S1に励起されます。追加の光子との对应により、図に示すプロセsukbを介して分子がさらに高次の状态に励起され、分子の解离が起こることがあります。あるいは、一重项状态励起は项间交差を介して三重项状态T1に移行することができ、この状态はk_oを介してそのエネルギーを一重项酸素状态に伝达することができます。

项间交差の正确率とは无关系に、MPEでは光子束が大きくなると、特にピークパワーが高いとき、3光子または4光子の对应の正确率が増加して高度な非线形项につながることは明らかです。

要约すると、生物学的试料上でreーザ出力を増加させた矩、最终的に线形（水や他の成分による吸收）または非线形（2P吸收がさらに1光子吸收またはそれ以上の光子吸收を引き起こし、光退色をもたらす）の光ダメージが発生します。MPE天博综合app官网登录における热ダメージは、パルsu幅（したがって平均出力）を短くすることで减少させることができますが、その结果、ピークパワーが増加すると、非线形光退色や他の形态のダメージが増加する可能性があります。したがって、热ダメージの减少と非线形效果の発生との间にはトラードオfuが存在する必要があります。

ダメージは波长にも依存します。多くの研究により、励起波长を700～800 nmから900～1,100 nmまで、さらに1,250 nmまで増加させると、试料の生存に优质であることが示されています。もちろん、すべてのプローブが长波长で起できるわけではありませんが、可能な限り励起supekutorunの赤色侧で蛍光色素分子を励起することが有利であると思われます。また、波长が长いほど散乱が少ないため、より深いイメージngグにも有效です。さらに良いことに、次のセクションで说明するように、波长が长いほど分散の影响を受けにくくなります。これらすべての要素により、MPEをより安全な920～1,100 nm领域で励起できるプローブが采用されるようになりました。

より长い波长に关する评价価は一致しているように见えますが、理想的なパルsu幅の选択は、より主観的、または観念的ですらあります。これ以上议论する前に、天博综合app官网登录shisutemuにおける短パルスの管理を复习しておくと最有价值です。

图1：[7]より引用した、高次非线形对应による光退色カカニズム

fuェムト秒パrusuの伝播の管理

特定の时间FWHM宽度のウルトライァーsutoreーザパルsuには、その时间パルsu形状によって支配される固有最小の周波数バンド幅を持っています。市贩のチタンfァイiasafuァイareーザに典型的なハイパーセカント形状（sech2型）のパルスの场合、次のようになります。

または波长の点では次のようになります。

时间とバンド幅の积が0.315であるSech₂型のパrusuは、変换限界であると言われています。たとえば、変换限界800 nm、100 fsのパrusuのバンド幅は、6.725 nmになります。実际には、完全なパルを达成するのは非常に难しく、チタン萨福ァイラーザのバンド幅は通常、変换限界の1.1～1.3倍です。

パルsuの幅が短くなるほど、バンド幅は大きくなります。これは重要です。なぜなら、広バンド幅パルsuは、多光子天博综合app官网登录などの复雑な光学系を通过すると、群遅延分散（GDD）と呼ばれる现象が発生するためです。波长ごとに光学材料の屈折率が异なることによって引き起こされるこの2次效果は、supekutorの赤い部分が青い部分よりも速く媒质を通过し、実质的にはパルsuが长くなるということを的意思是します。このようなパルスは、ポジティブチャープと呼ばれます。パrusuのバンド幅が大きいほど、パルsuはより长くなります。

マルチfoton天博综合app官网登录用に特别に设计された自动化oreーザの第1世代（变色龙） XR）は、复雑な対物连ズ、変调器、その他いくつかの反射素子を含む天博综合app官网登录shisutemuの典型的なGDDに合わせたパrusu幅で动作しました。図2は、约140 fsのパルsu幅が、広范な天博综合app官网登录のGDDに対していかに最适に近いかを示しています。

图2：异なる入力パルsu幅と天博综合app官网登录の复雑さに対するパルsu広がり。これは、広范囲の条件下で、140 fsのパrusuがどのように最短のパルsuを试料に供给するかを示しています。

天博综合app官网登录shisutemuの群遅延分散（GDD）は波长に强く依存しており、一般的に1000 nmを超える波长よりも短波长の方が、はるかに高くなります。shisutemuの総GDDは、GVD（群体速度分散）と材料の长さの积です。典型的なGVDデータについては、図3を参照してください。仿制光学変调节器で使用される最も一般的な材料である二酸化テルル（TeO2）の高い效果に注目してください。

适应に复雑な天博综合app官网登录では、1,050 nmを超える波长では総GDDが8,000 fs2未満です。したがって、非常に短いパルスを除いて、パルス広がりは强い悬念事项ではありません。実际、このような条件下では、1,100 mで200 fsのパルsu幅は最大230 fsまで伸びるだけです。

图3：市贩の2P天博综合app官网登录で使われている典型的な光学材料のGVD。

fuェムto秒reーザにおけるGDDの前置补偿

図2から明らかなように、総GDDが8,000 fs2よりかなり大きいい场合、120 fs未満のパルスで试料面でのパルス幅が剧的に増加します。これは、変调器（AOMまたはEOM）が天博综合app官网登录shisutemuで使われている场合に非常に一般的であり、ほとんどの市贩MPE天博综合app官网登录では通常行われています。

この影响を急するために、立足したエンドユーザーとreーザ企业は、光学系に入力する前にパルスに负のチャープを加えることによって、2次のGDDを反向补偿する方法を考案することに成功しました[10]。これは、図4に示すように、平均雷ーザ出力を一定に保ちながら、画像の辉度に顕着な影响を与える可能性があります。

使用する波长が一定で、负のチャープの量や変动が制限されている限り、実际のGDD前置补偿は、チャープミラー [11]を使用して実装することができます。ただし、一般的な市贩の波长可変チタンサfuァイia reーザシテムは、プリズムペアコンプラッサをベースとした分散补偿机能を备えています[12]。このシsutemuは、プurizumusuテージを电动化することで、完全に自动化できます。

図5に示すように、ユーザーは选択した长度に対して试料面でのパルsu幅を最小化できるように、特定の天博综合app官网登录に合わせたGDD曲线を设定できます。

パルsu幅を动的に変更できることは、ピークパワーの最大化などの利点があり、光毒性によるダメージが悬念される场合にはパルsu幅を大きくすることが望ましい场合もあります。研究では、チャープ（つまり、引き伸ばされた）パルsuがそのようなダメージを最小限度に抑制える效果的な方法であることが示されています[2]。

图4：分散补偿により画像の辉度が増した例。reーザ出力と検出ゲインは一定ですが、GDD设定はA：0 fs2、B：10000 fs2、C：15000 fs2と変化させています。格勒诺布尔神经科学研究所提供によるCY3标识グria细胞の840 nmイメージngu。

图5：分散补偿チタンサfuァイareーザの负のGDD曲线。い青线の下の値はどれも、カスタマイズされたユーザー圆形にプログラムできます。

分散补偿の有无にかかわらず、reーザを选択する际には実用的な事项があります。考虑すべき点は以下のとおりです。

reーザはより复雑で大型です。プuriズムベーsuのコンプuressaーにより、reーザ出力に少なくとも2～3メートルの光路长が追加されます。エレガントなビーム折り畳み技术にもかかわらず、通常、前置补偿部により、reーザの长さが最大30 cm长くなります。
プuriズム自体もビームにある程度の波面歪みを加え、それによりビームに非点收差が加わります。これは、画就像の点広がり关系数に影响を与える可能性があります。reーザの构筑プロセsuと设计のベsutopurakuteisu、このような影响も补偿します。
プuriズムによる透过率损失が几个あります。通常、效率は宽度に応じて80～90%です。非常に高い平均出力を必要とするアプリケーショは、これは重要なる可能性事项となる可能性事项があります。
特定の天博综合app官网登录构成に合わせて正しい曲线を设定することが重要です。そうでない场合、误って短いパルではなく长いパルスを试料に与えてしまう可能性があります。

一般に、100 fs未満のパルsuを持つreーザは、ごく単纯な光伝送列を除き、分散补补の恩恵を受けることができます。実际、そのようなoreーザにはこの机能が必要であると言えるでしょう。140 fs程度のパルを持つreザの场合、利点は前置补偿テージの余分なコsutoとサイズの影响を必ずしも上回らないかもしれません。ただし、これにより、様々な种类のサンプルをより柔软に使用できる实用があります。

分散补偿と70～80 fs程度の非常に短いパルスの両方を备えたチタンサfuァイareーザを选択する场合、前置补偿プuriズムの适切な设定が特に重要です。より定期的な间隔で适切なreーザ操作と最适化が必要になる场合があります。例として図6を参照してください。

图6：代表なチタンサfeiareーザパルsuに対するGDD设定の感度。パルsuが短いほど、最高のパfuォーマンsuを确保するためにGDD设定に注意が必要です。

短すぎるとはどの程度の短さか？

自动分散补偿を备えたを备えたチタンサfeiareーザの市场でのを考えると、なぜoreーザパルsuをできるだけ短くしないのでしょうか？このようなベンチャーの成功には、いくつかの重要な否定があります。

波长可変reーザの范囲では、光学设计の限界关系により、平均出力と波长可変领域はトoreードオfuのにあります。たとえば、140 fsのチタンサァイラーザは、680 nmから1080 nmまで调整可能です。75 fsのパルsuは本来バンド幅が広いため、チタンサfuァイアの蛍光発光supekutorunの端に近づけることができず、约1050 nmが限界です。これは、mCherryのような赤色蛍光タンパク质を画像化したいユーザーにとって重要です。さらに、reーザのsupekutorが100 nmを超えると、その形状が滑らかなガウス分布から乖离する纹があり、その结果、一部のスペクトル成分において実际の励起が最适化されなくなります。

非常に短いパルスの広いバンド幅は、撮像される蛍光マーカー背景のでも考虑する必要があります。2光子の断面は、通常、対応する1光子の断面よりも広いですが、通常は100 nm未満であり、さらに、断面は実际のパルス幅に依存する可能性があります[13、14]。超広帯域パルスは、个々のマーカーに対応するためではなく、多くのプローブを同时に励起するために采用されるのが一般的です。例外として考えられるのは、fuェーズマッチングが比较的波长に依存しない高调波発生天博综合app官网登录や、数百ナノメートルのバンド幅を持つ量子ドトの励起です。このような场合、非常に短いパルスを使用することで高い信号が得られますが、MPEで50 fs以下のパルsuは散発的に使用されているだけです。

これまでの分散に关する议论は、2次の分散效果にのみ焦点を当ててきました。3次分散（TOD：三阶）分散）は、より复雑な天博综合app官网登录shisutemuで超広バンド幅パrusuを使用する场合にも考虑されます。これはGDDに対する周波数依存性であり、fs3の単位で表されます。TODはGDDよりもモデル化が难しく、プリズムだけでは反向补偿できませんこの效果についての议论は今回の目的からは外れますが、一般的な指针として、约30 fs以下のパrusu（または同等のバンド幅のパrusu）を持つreザでは、效率的な多光子励起のために、パルスの位相制御用のより复雑なシsutemuが必要になります[15]。

概要

生体内神経科学のためのオプトジェネネテティクスや生理学を含む、一般的に关心のあるほぼすべての非线形天博综合app官网登录アプリケーションは（reーザ光源からの）50～200 fsの范囲のfuェムト秒パルスで対応できます。约100 fs以下のパルるを生成するるザ光源は、ピークパワーの劣化による励起の损失を避けるために、前置补偿を使用する利点があります。すべての光学材料のGDDは、波长が长くなると强く下するため、1ミクロン以上の波长では、反向补偿の必要性はそれほど厳しくありません。使用する长度关系なく、平均出力やピークパワーの増加は、最终的にそれぞれ线形（热）または非线形ダメージをもたらします。2种类のダメージの间にトoreードオfuはしますが、试料によって、また波长の关数としても异なります。また、実験観察の时间suke依ルにも存します。一般に、试料の面でより高いピークパワーを利用できるようになると、柔软性が増し、线吸收が大きく热损伤の影响を受けやすい试料でも、より多くの蛍光を起できようになります。さらに、高分散の光学天博综合app官网登录を使っているユーザーにとっては、GDDの边界补偿を加えることで、画像の辉度に关してメrittoが生じます。これにより、reーザに加わるコsutoと复雑さを许容できるかもしれません。