白皮书
非线性天博综合体育中国官方网站中的峰值功率：解开修辞学
多光子激发（MPE）天博综合体育中国官方网站已将飞秒激光器带入生物学研究实验室已有20多年了。所需的波长范围可以激发各种探针和与低损伤的象征成像兼容的激光功率。但是，适当的脉搏持续时间仍然是讨论，个人偏好和不同实验条件的主题。该白皮书提供了有关非线性成像应用的飞秒脉冲传播和管理的有用信息。
简介
自Denk等人的开创性成就以来。在两光子激光扫描荧光天博综合体育中国官方网站中，采用非线性成像和专用的超快激光器已大大扩展[1]。同时，激光技术的能力，可用性和灵活性已大大增强。
最初的工作以复杂的染料天博综合体育中国官方网站技术为主，
在选择用于多光子荧光兴奋或照相激活的激光技术时，存在许多关键的技术考虑因素。选择特定的波长或波长范围是一个相对简单的过程，是由荧光探针的充分记录的激发横截面光谱驱动的。更困难的是选择最佳功率或天博综合体育中国官方网站功率制度。
有几个原因的原因，主要是因为一方面样品损伤和荧光强度与平均功率，峰值功率和波长之间的相互作用。为了进一步使问题复杂化，在文献中可以发现，MPE是用680至1,300 nm的波长进行的，脉冲在5 fs和1-2 ps之间，以及在数十只picojoule和microjoules之间的样品中的能量/脉冲。此外，现代激光器具有通过在天博综合体育中国官方网站系统的光学序列中进行线性分散的预启动器来传递这些短脉冲的能力。结果，在选择中有一些模棱两可和个人喜好的空间，通常由过去的经验决定，也可能不适用于新实验。该白皮书的目的是根据涉及连贯的变色龙家族的应用程序提取的数据点提供一些准则。
背景：非天博综合体育中国官方网站荧光激发
我们将首先假设读者具有生物样品多光兴趣的原理和优势的基本背景。可以说，对于单个天博综合体育中国官方网站，瞬时峰值功率越高，2（或更多）光子吸收的概率就越大。随之而来的是会有更多的荧光激发，因此可以检测到更多的发射。
激光天博综合体育中国官方网站的峰值功率虽然严格取决于确切的时间剖面天博综合体育中国官方网站，但通常写如下：
激光的天博综合体育中国官方网站能为：
PAV是激光的平均功率，F表示天博综合体育中国官方网站重复率，TP表示FWHM天博综合体育中国官方网站持续时间。
对于激光扫描天博综合体育中国官方网站，激发探针的荧光寿命相对较短，时间平均发射也取决于可以将这些脉冲传递到样品的速率。为此，可以将总荧光产率写为激光器的时间平均功率和峰值功率的乘积：
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用参数表示这很有帮助，这些参数通常在商业激光系统数据表中找到，例如平均功率，天博综合体育中国官方网站宽度和重复率。因此：
从这里开始，可以调整哪些天博综合体育中国官方网站参数以增加样品的荧光是相对简单的。捕获是，并非所有这些参数都可以自由调整，而无需妥协以样本可行性，技术可用性和/或成本。这些权衡现在将分别探索。
多光子天博综合体育中国官方网站中的摄影仪
尽管有许多有关光毒性和天博综合体育中国官方网站光损伤的参考和论文，但仍有相对较少的靶向，系统和定量研究探索这些动力学，以探索这些动力学的体内和体外MPE MPE方法和样品类型。
可以从Hell等人那里获得一些出色的见解和背景。 [2]和Koenig [3]。本节中的大多数讨论都是由地狱[2]，活塞[4]，Neher [5]领导的小组得出的，以及Cheng等人对照片漂白机制的理论分析。 [6,7]激光损伤的一个公认的原因是光热相互作用。这是通过线性吸收超快激光源的基本波长，或任何其他CW或天博综合体育天博综合体育天博综合体育中国官方网站官方网站官方网站激光源的线性波长。线性吸收高度依赖于样品类型和波长（S），但与样品吸收的平均功率仅相关，而没有与瞬时峰值功率相关的任何效果。例如，在大多数生物样品中，水在附近IR中具有特定的吸收系，并且通常，当使用1350 nm以上的波长时，其吸收变得更加显着。对样品的影响包括局部加热，以及最终在样品中沸腾的水，导致气蚀。应当指出的是，损害可能发生在空化发生之前，即当局部温度升高超过细胞活力的极限。地狱等人。 [8]仅通过线性吸水确定了对标本中温度升高的简单但令人信服的评估。他们表明，MPE中使用的典型平均功率（焦平面上约100 mW）决定了温度升高<1°C，并得出结论，在这些样品中，由于MPE所需的激光造成的激光损害并不是问题。但是，重要的是要认识到，在由于其他物种（例如血红蛋白或黑色素）引起的强吸收的情况下，样品温度可能会升高得多。例如，在人皮肤中，2p光渗透通常受到黑色素吸收的限制[9]。在仅存在线性效应的情况下，可以通过减少脉搏持续时间并增加对非线性激发有益的峰值功率来最大程度地减少这些影响。
光漂白是一种机制，可导致由于荧光物种本身的降解，导致样品荧光发射的迅速减少。通常，光损伤一词被用来表明光漂白是造成光引起损害的主要原因，尽管可能还有其他一些机制在长期内发生。这些机制可能是由与光漂白有关的化学变化触发的，但可能比光漂白本身的时间尺度更长的时间（几秒钟或数十秒）进行。光漂白的机制在其各个方面都很复杂，主题进行了主题。虽然光漂白都以1光（2光量激发）进行，但如果有2光量激发，则将其局限于焦平面。人们已经认识到，在存在飞秒天博综合体育中国官方网站的情况下，光漂白可能会随着2次的功率而增加，表明2光子和3光子过程的混合物，甚至更高阶段的过程[4，5]。图1显示了关于光漂白的较高非线性的简单解释。在这里，染料（或荧光蛋白）分子通过2光片的吸收激发到第一个单重态S1中。与其他光子的相互作用通过过程Kb激发了分子到更高的状态，可能导致分子解离。或者，单重状态激发可以通过交叉交叉传输到三重态T1，该状态可以通过K传递其能量到单线氧状态O.
独立于间间穿越的概率，很明显，MPE中较大的光子通量，尤其是在高天博综合体育中国官方网站功率下，会增加3-或4光子相互作用的概率，从而导致高度非线性项。
总结，增加生物标本上的激光功率最终会导致光损伤可能是线性的（水和其他成分吸收）和非线性（2P吸收导致在光渗透中导致其他1或更多的光子吸收）。通过减少脉冲持续时间（因此是平均功率），可以减少MPE天博综合体育中国官方网站的热损伤，但是峰值功率的增加可能导致较高的非线性光漂白或其他形式的损害。然后，在热损伤的减少和非线性效应的发作之间必须取消权衡。
损坏也取决于波长。许多作品表明，激发波长从700-800 nm增加到900-1,100 nm，甚至1,250 nm对样品可行性有益。当然，并非所有探针都天博综合体育中国官方网站用长波长激发，但是在可能的情况下，将荧光团激发在其激发光谱的红色侧似乎是有利的。这也很有用，因为较长的波长经历较少的散射，因此也有利于更深的成像。如下一节所讨论的，更好的是，更长的波长更容易受到分散的影响。所有这些元素都将MPE推向采用天博综合体育中国官方网站激发的探针的采用更安全920-1,100 nm区域。
虽然对较长波长的评估似乎是一致的，但选择理想的脉冲持续时间仍然更加主观甚至意识形态。在进行进一步讨论之前，回顾天博综合体育中国官方网站系统中短脉冲的管理很有用。
图1：通过高阶非天博综合体育中国官方网站互动的光漂白机制，改编自[7]
管理飞秒天博综合体育中国官方网站的传播
特定时间FWHM宽度的超快激光天博综合体育中国官方网站具有固有的最小频率带宽，由其时间天博综合体育中国官方网站形状控制。对于典型的商业ti：S激光器的高体天博综合体育中国官方网站（SECH2），这是由以下内容给出的：
或以天博综合体育中国官方网站为角度：
sech2天博综合体育中国官方网站，据说具有0.315的时间带宽产品变换限制。例如，转换限制的800 nm，100 fs天博综合体育中国官方网站的带宽为6.725 nm。实际上，一个完美的天博综合体育中国官方网站很难实现，对于ti：S激光器，带宽通常比变换极限高1.1-1.3倍。
较短的脉冲变为宽度，带宽越大。这很重要，因为当通过复杂的光学系统（例如多光子天博综合体育中国官方网站）时，宽带脉冲显示出一种称为组延迟色散（GDD）的现象。由不同波长的光学材料的不同折射率引起的，这种二阶效应意味着，光谱的红色部分通过中等速度传播的速度比蓝色部分快，从而有效地延长了脉冲。这样的脉冲被称为正面chi。脉冲的带宽越大，脉冲的延长越长。
第一代自动激光器专门为多光子天博综合体育中国官方网站（Chameleon XR）设计的，该激光器是在沿典型的天博综合体育中国官方网站系统典型GDD量身定制的脉冲持续时间内操作的，包括复杂的物镜，调制器，调制器和其他一些反射元素。图2说明了大约140 fs的脉冲如何接近广泛的天博综合体育中国官方网站GDD的最佳。
图2：不同输入脉冲持续时间和天博综合体育中国官方网站复杂性的脉冲拓宽。它证明了〜140 fs的脉冲如何在最宽的条件范围内传递最短的脉冲。
天博综合体育中国官方网站系统的GDD非常依赖于波长，并且在较短波长处的波长通常要高于1000 nm以上的波长。系统的总GDD是材料长度的GVD（组速度分散）的乘积。有关典型的GVD数据，请参见图3。请注意TEO2的高效果，TEO2是声音调制器中最常见的材料。
适度复杂的天博综合体育中国官方网站在1050 nm以上的波长中的总GDD低于8000 FS2，因此，对于所有人而言，脉冲扩大并不是所有脉冲，而是最短的脉冲。实际上，在这种条件下，脉宽为200 fs，在1100m处只能延伸至〜230 fs。
图3：GVD用于商业2P天博综合体育中国官方网站中的典型光学材料。
在飞秒天博综合体育中国官方网站器中的GDD的预补偿
从图2可以清楚地清楚样品平面的脉冲宽度如何用小于120 fs的脉冲急剧增加，而总GDD高于8000 FS2。当天博综合体育中国官方网站系统中包含调制器（AOM或EOM）时，这很常见，这是大多数商业MPE天博综合体育中国官方网站的常规实践。
为了避免效果，熟练的最终用户和激光公司成功地设计了方法，通过在输入到光学系统之前向天博综合体育中国官方网站中添加负面chirp来预偿二阶GDD [10]。如图4所示，这可以对图像亮度产生明显的影响，同时保持平均激光功率恒定。
只要使用的波长被固定并且负chirp的数量或可变性受到限制，就可以使用the镜[11]进行GDD预偿的实际实现。但是，基于Prism-Pair压缩机[12]，典型的商业，可调节的Ti：S天博综合体育中国官方网站系统现在可以提供分散补偿。该系统可以通过电动棱镜阶段完全自动化。
用户可以设置针对其特定天博综合体育中国官方网站量身定制的GDD曲线，以便可以将样品平面处的脉冲宽度最小化，如图5所示。
动态更改天博综合体育中国官方网站宽度的能力可以具有最大化峰值功率，在某些情况下，当关注的光毒性受到损害时，可能需要增加天博综合体育中国官方网站宽。研究表明，搅动的天博综合体育中国官方网站（即拉伸）天博综合体育中国官方网站可以是最大程度地减少这种损害的有效方法[2]。。
图4：通过分散补偿增加图像亮度的示例。天博综合体育中国官方网站功率和检测增益保持恒定，但对于a：0 fs2，b：10000 fs2和c：15000 fs2的GDD设置有所不同。 840 nm的CY3成像标记为神经科学研究所的神经胶质细胞。
图5：分散补偿的负GDD曲线：S天博综合体育中国官方网站器。蓝线下的任何值都可以编程为自定义的用户曲线。
在选择有或没有分散补偿的天博综合体育中国官方网站器时，存在实际的考虑。考虑因素包括以下内容：
- 天博综合体育中国官方网站更复杂且更大。基于Prism的压缩机至少为天博综合体育中国官方网站输出添加至少2-3米的光路长度，尽管优雅的梁折叠工程工程，但通常情况下的预偿部分为天博综合体育中国官方网站长度增加了约30厘米。
- 棱镜本身还会向光束增加一定数量的波前变形，这又在光束上增加了散光。这可能会影响图像的点扩散函数。天博综合体育中国官方网站构建过程和设计中的最佳实践也可以弥补此类效果。
- 通过棱镜有一些传输损失。通常，取决于波长，效率在80％至90％之间。对于需要非常高平均天博综合体育中国官方网站的应用程序，这可能是一个重要的考虑因素。
- 为特定天博综合体育中国官方网站配置设置正确的曲线很重要；否则，可能会无意中提供更长的时间，而不是较短的脉冲到样品中。
一般而言，天博综合体育中国官方网站<100 fs的激光器将从分散补偿中受益，除了最简单的光学输送列车外，所有的天博综合体育中国官方网站补偿都将受益。实际上，几乎可以说这样的激光需要这种设施。对于具有140 fs天博综合体育中国官方网站的激光器，好处可能并不总是超过预偿阶段的额外成本和大小的影响。但是，这可能会导致更大的灵活性用于多种样本类型。
如果选择具有分散补偿和非常短的天博综合体育中国官方网站的Ti：S Laser，则以70-80 fs为单位，则预先计算棱镜的正确设置尤其重要。可能需要更常规的间隔需要适当的激光操作和优化，请参见图6作为示例。
图6：GDD设置对典型Ti：S激光天博综合体育中国官方网站的灵敏度。较短的天博综合体育中国官方网站需要对GDD设置进行更多的护理，以确保最佳性能。
太短有多短？
鉴于具有自动分散补偿的ti：S激光器的市场成功，它可能会导致人们问为什么不使激光天博综合体育中国官方网站尽可能短？有一些重要的局限性已同谋限制此类企业的成功。
在可调激光器的范围内，光学设计的局限性意味着平均功率和调谐范围在平均功率和调音范围内进行了权衡。例如，具有140 fs的Ti：S激光器可以从680 nm调整为1080 nm。一个75 FS天博综合体育中国官方网站由于其固有的较宽带宽，无法如此接近Ti：S的荧光发射光谱的边缘，因此仅限于〜1050 nm。这对于希望成像红色荧光蛋白（例如MCHERRY）的用户很重要。另外，随着激光光谱超过100 nm，其形状往往与光滑的高斯分布不同，从而在某些光谱成分处产生了亚最佳的实际激发。
在要成像的荧光标记的背景下，也应考虑非常短的脉冲的更宽带宽。两光子横截面通常比单个光子对应物宽，通常<100 nm，此外，横截面可能取决于实际的脉冲宽度[13，14]。超宽带脉冲已被更常见地激发了许多探针同时激发许多探针，而不是解决单个标记。可能的例外是谐波产生天博综合体育中国官方网站，其中相位匹配是相对非波长独立的，或激发量子点，因为这些探针显示数百纳米的带宽。在这些情况下，使用非常短的脉冲会导致高信号，然而，MPE中的50 fs脉冲仅偶发地采用。
迄今为止的分散讨论仅关注二阶分散效应。三阶分散（TOD）也可能是更复杂的天博综合体育中国官方网站系统上的超大型带宽脉冲的考虑。这是对GDD的频率依赖性，并以FS3的单位表示。 TOD比GDD更难建模，并且不能仅凭棱镜就可以预熟。讨论这种效果超出了我们目前的目的，但是作为一般指南，脉冲的激光器大约为30 fs或更低（或等效带宽）将需要一个更复杂的系统来进行脉冲的相位控制，以进行有效的多光子激发[15]。。
摘要
几乎每种非线性天博综合体育天博综合体育中国官方网站官方网站应用普遍兴趣，包括光遗传学和生理学的体内神经科学，可以用50-200 fs（来自Laser source）的二秒脉冲来解决体内神经科学。产生低于100 fs的脉冲的激光来源受益于使用预偿，以避免由于峰值降解而引起的激发损失。在1微米以上的波长上，对预补偿的需求不太严格，因为所有光学材料的GDD在更长的波长下强烈降低。独立于使用的波长，增加平均功率和/或峰值功率最终会导致线性（热）或非线性损伤。存在两种类型的损害之间的权衡，但从样本到样品也有所不同，也是波长的函数。这也取决于实验观察的时间尺度。通常，在样品平面上访问较高峰值功率的能力增加了灵活性和能力，可以激发高线性吸收的样品中更多的荧光，从而更容易受到热损伤。此外，对于非常涉及的光学天博综合体育天博综合体育中国官方网站官方网站的用户，添加GDD的预补偿将获得图像亮度的优势，这可以很好地证明激光的增加成本和复杂性。