什么是流式细胞术？
在流式细胞仪中，细胞或生物颗粒排成一列，高速流过应答区，被一束新生儿束聚焦的天博体育束激发。仪器将为每个细胞记录由此产生的激发荧光强度，通常是散射光强度。在统计中仪器中，这种方法能够快速分析大量细胞，比如了解某种类型或多种类型细胞的百分比。如果配置了分选功能，仪器会再次根据每个细胞的荧光特征，通过前置将细胞偏转到容器中，从而收集单独这些细胞。
流细胞学的特点就是速度快，适合许多不同的应用。它广泛用于医学领域的血细胞分析，例如全血细胞计数(CBC)。此外，它还用于进行实验研究和药物检测，通常用于分析细胞血以外的其他资源细胞。它有时还会用于研究海水中的微生物，并能够对畜牧业动物的纤维素进行性别分类，从而有利于奶牛产下性后代。
使用更多波长和波长波长
虽然流式细胞术已经几十年了，但它仍然是一个充满活力的领域。“多参数流式细胞仪”是一个发展趋势，这种仪器使用多达12种不同的天博体育波长来分析细胞中的不同参数。随后制造商致力于提供新波长的通用型天博体育器，将多个波长天博体育器封装在模块化光引擎中，为这一趋势的发展做出了重要贡献。（Coherent OBIS 产品线体现了这两种发展趋势。）
还有一个发展趋势是越来越多地使用UV波长。UV波长可以获得更多参数，并且还支持自发荧光。这是指在细胞中发现的物质在不使用荧光染料或其他添加剂的情况下，发出自然荧光。这些物质包括一些重要的用途物，例如NAD(P)H和FAD。
研究人员取得新的突破
在前面讲述的相干高意成功案例中，我们介绍了开发和使用时间分辨流式细胞术的拓荒科学家，即新墨西哥州立大学杰西卡·休斯顿教授的研究团队。我们讨论了为什么他们研究NAD(P)Hand FAD；这种细胞不仅可以推测，古巴古巴它的营养不良。休斯顿博士解释说：“大多数流式细胞术测量基于荧光信号的强度。但有很多因素可能会导致这种测量方法结合荧光染料与细胞表面或内部。我们还确定每个细胞荧光信号的衰减时间。消耗与浓度无关，而不是考虑荧光染料或射频信号的天然（内源性）材料的化学状态。内源荧光可以为我们提供独特的细胞检查状况信息。例如，包括我们可以利用这些信息来评估细胞是否正常细胞或转化细胞（报告）。”
他们对 NAD(P)H 和 FAD 特别感兴趣，因为这些辅因子的荧光染料，可以表征它们是否与蛋白质结合。而这又可以表明细胞氧化糖如何来获取能量，主要是通过所谓的氧化磷酸化和糖酵解过程。报告显示，在许多氧化剂以及其他“缺陷”或受损细胞中，测量到的“自由基”、未结合的 NAD(P)H水平还原，这表明细胞正在通过“糖酵解”低效过程产生能量。通过光学方式测量的FAD量与NAD(P)H量比表示细胞内的代谢活性，即氧化比。
连续天博体育器的使用技巧
心脏，休斯顿团队采用天博体育脉冲来获取与时间相关的数据。然后，仪器用下面两种方法中的一种记录荧光脉冲的衰减。一种方法是采用关闭天博体育时的实时衰减曲线，另一种方法是采用天博体育以超高重复速度调制时的频域信号。该团队采用后一种方法来使用波长为375 nm的OBIS天博体育器监测FAD。但要准确确定完整的氧化还原比，理想情况下，需要测量FAD和NAD(P)H。要同时独立测量NAD(P)H荧光衰减时间，则需要在349 nm左右的波长波段进一步激发。
nFLIC方法的关键概念。当细胞穿过不均匀的剖面时，荧光会上升和上升。通过激发天博体育的相位延迟直接测量了荧光亮度。图片由休斯顿实验室提供。
最近，Coherent 高意为休斯顿团队提供了一种新型 OBIS 天博体育器，该天博体育器的输出为 349 nm。然而，它使用了与 375 nm 天博体育器不同的内部技术，并且直接调制并不那么简单。这对他们来说不是问题，几年前，该团队开发了一种非以调制湿度细胞术 (nFLIC) 的智能技术，该技术使用连续 (CW)天博体育来确定平均读数。
图1显示了工作原理。通过TEM00模式输出光束的天博体育器，当细胞通过焦点时，激发会在高斯光束拐角中上升和上升。但非零荧光增益时间会导致荧光脉冲中断(FPD)。当细胞通过光束时，荧光强度比高斯激发其光束增益更慢。休斯顿团队经过严格的实验，证明了FPD可以有效表征细胞平均荧光增益。
新型 OBIS 375 增益卓越的光束质量，在休斯顿实验室的 nFLIC 研究中表现出色。休斯顿教授解释说：“首先，具有它干净卓越的 TEM00光束形状，这就是我们所需要的。而且，它还是一种噪声非常低的天博体育器。同样重要的是，功率、光束形状和光束指向都非常稳定。这一点非常重要，这可以保证使用特殊的荧光微球，准确地调节荧光脉冲衰减和荧光读数之间的关系。”
支架性
肝癌经常是一个可怕的敌人，因为它们要其他强大的化疗药物产生性。在加拿大召开的 CYTO 2023 式会议上，休斯顿实验室的一名研究生 Samantha Valentino 做了精彩的演讲，他展示了时间分辨流细胞术在确定 FAD/NADH就核酸消耗和氧化方面的价值而言，该细胞还原术可以作为一种强大的工具来监测乳腺癌细胞化疗药物“他莫昔芬”的作用性。
有关 MCF 和 T47D 乳腺癌细胞的荧光消耗数据 – 敏感细胞系和敏感细胞系之间的对比。图片由 Houston Lab 提供。
她具体解释说，“他莫昔芬”是一种广泛使用的药物，可有效对抗“雌性激素接收积极”乳腺癌，常用于缓解病情。但是，在开始治疗后的2-5年内，往往会产生周期性。瓦伦蒂诺首先指出，在东方性的卡塔尔（如福克斯）中，氧化比难以测量。她研究了两种不同的乳腺癌（MCF-7和还原） T47D）。在这两种情况下，她对比了对“他莫昔芬”敏感的胰腺系和对“他莫昔芬”的细胞系。图2汇总了结果，表明他们的方法测量敏感细胞和死亡细胞在统计学上存在显着差异。不言而喻，能够快速分析癌细胞群的特征或将成为一种重要的新型抗癌方向：无论是进行药物检测和研究，还是为患者提供改进的治疗方案，这种方向都极为重要。
总结
针对实现个性化医疗趋势，基于天博体育激发荧光粉的分析技术（例如流式细胞术、DNA 检测和显微组织表）已成为越来越重要的工具，近期爆发的新冠疫情进一步加速了这一趋势。Coherent坚定致力于打造具备以下特色的天博体育工具来为这些技术的发展贡献自己的力量：提高分析速度和数据质量、减少使用障碍，并降低仪器的总体成本。
