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天博体育app 新墨西哥州立大学：时间分辨流式细胞仪
挑战
新墨西哥州立大学的杰西卡·休斯顿教授研究小组研究了可以使用天博体育app测量的独特方法流式天博体育app术。使用荧光终身测量值，该组的一个重要重点是癌天博体育app的代谢图（评估其活力）。另一个关键应用使用Förster（荧光）共振能量转移（FRET）和荧光蛋白的基本天博体育app信号传导和受体活性。
休斯顿指出，天博体育app流式细胞术与大多数依赖稳态荧光强度数据以执行计数和分类功能的大多数现有流式细胞仪应用明显不同。并且针对稳态数据进行了优化的市售流式细胞仪不适用于她的研究。因此，作为第一步，她的小组不得不建立自己的流式细胞仪。
有两种众所周知的方法来测量荧光寿命：在时域中使用脉冲激光或其他光源或在频域中。 Houston explains, “We need a high throughput flow cytometer in order to non-destructively count and/or sort huge populations of cells, e.g., for studying metastatic cancer cells in the blood for example. And time-domain measurements using photon counting would not support the necess天博体育app育app育app育app育appy throughput. So we decided to work in the frequency domain, where the established method is to apply a modulation to the excitation laser and correlate the observed phase shift in the modulated荧光发射。”
解决方案
休斯顿集团希望能够在其工作中使用许多不同的荧光团，除了查看NADH和FAD等代谢产物的内源性荧光外。因此，他们需要多个天博体育app波长来有效激发所有这些不同的目标。他们还需要具有良好模式质量的天博体育app器，即低M2以及高稳定性输出，从光束指向和功率噪声方面。
经过仔细的评估，他们决定使用Coohent的OBIS天博体育app器。休斯顿指出：“我们目前有几个波长的OBIS天博体育app器，包括375 nm，405 nm，488 nm和633 nm。这些智能天博体育app器非常适合我们的工作。除了它们的高质量输出外，它们还支持快速直接的数字调制我们的工作需求，而且还可以轻松地添加和删除这些插件和播放和播放这些插件和播放天博体育app器，并确定这些功能和匹配。她指出，10s甚至100毫米的可用性是另一个重要的OBIS功能。这是因为她的许多实验基于频域的寿命测量值，其中数字调制基本上使流动池的天博体育app功率降低了50％。
结果
休斯顿指出，她的定制流式天博体育app仪和她越来越多的OBIS激光收集已被证明是成功的组合，并且已经为她的代谢分析研究以及FRET工作提供了大量数据。
对于代谢分析，她引用了NADH的例子，其中测得的荧光寿命取决于该代谢物是否主要处于所评估的天博体育app中的结合状态或未结合状态。这与天博体育app产生ATP的方式相关，这是大多数天博体育app活性为大多数供电的能量分子。正常天博体育app中的代谢活性主要依赖于线粒体氧化磷酸化（OXPHOS）来产生ATP。但是在许多类型的癌天博体育app中，糖酵解在ATP产生中起着更大的作用，OXPHOS的容量降低了。因此，休斯顿组可以将NADH寿命用作天博体育app如何应对新型治疗的定量度量。
该组还使用该系统快速获取定量FRET数据。他们正在分析这些数据，以更好地了解蛋白质 - 蛋白质相互作用，用于蛋白质构象研究和探测酶作用。休斯顿指出：“我们可以看一下供体荧光团是否处于淬火状态。我们还可以同时捕获供体排放和受体排放。同样，这些数据可以表明癌症治疗学的有效性。底线，OBIS激光器和我们的高通量天博体育app计算机真正提供了数据丰富的数据。
参考：
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- 杰西卡·休斯顿（Jessica Houston），美国新墨西哥州拉斯克鲁塞斯（天博体育apps Cruces），新墨西哥州大学化学与材料工程系教授（CHME），美国。
图1.天博体育app流式细胞仪的关键元素。
图2 组装天博体育app的流式细胞仪。