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高分辨率，生命速度的多色天博体育app成像
一种创新的激光荧光技术，扫描共同对齐的平面激发（SPAPE）显微镜，
克服早期方法的局限性并提供广泛的生命科学实用程序。
概述
不同生命科学领域的研究人员有共同的需求天博体育app荧光显微镜工具以高速，高像素计数和单细胞分辨率为特征，并且可以获取图像而不会引起标本的显着光损伤。尽管有许多发展和技术改进，但是大多数已建立的技术仍然涉及折衷至少这些参数之一的权衡。
图1：在Scape中，通过线轮廓梁（A）的主要显微镜物镜的离轴照明以斜角的形成灯纸； Scape通过扫描轻纸来构建体积图像，同时捕获一系列照明平面的图像（b）。
进度和权衡
例如，共聚焦显微镜由于物理扫描单个位置的速度限制，因此无法以高分辨率为高分辨率的大XYZ体积。此外，每个像素的停留时间很短，意味着最快的共聚焦扫描需要高激光功率，从而导致显着的光损伤。
while两光子显微镜急剧减少了光损伤，这种单点方法面临速度/分辨率/音量折衷导致的相同问题。最近开发的快速声音调节器（AOM）现在可以更快地扫描小型预选的体积，但是这种方法对大容量或移动生物的使用有限。
传统的轻板显微镜使整个XY平面同时进行采样，但它需要横向样品访问（因此是特殊准备），以及时间来构建天博体育app数据的立方体。此外，光学和舞台运动的同步使这些技术变得复杂而缓慢。
伊丽莎白·希尔曼（Elizabeth Hillman）教授及其同事在哥伦比亚大学的Zuckerman Mind Brain Brain行为研究所（纽约州纽约）开始开发一种创新的方法，以避免这些限制，同时支持一系列挂载和未固定的样本地形。他们的成功结果是扫过共凝结平面激发（SPAPE）显微镜，该显微镜首先在2015年出版物中进行了描述。1在2019年报告了更新版本Spae 2.0，2和Leica Microsystems认识到其广泛的生命科学实用程序，现在已许可。
如何工作景点
希尔曼解释说：“我们认为，真正的高速天博体育app可能永远不会来自单个甚至多点扫描。即使我们能够获得所需的扫描速度，每个像素的停留时间也太短了，无法获得可接受的system niber System nim System at System at System pimy nim System pimy。在样本周围。
团队意识到，通过高数值驱动物镜的边缘使用离轴路径，可以在45°的微观XY平面上创建激发灯表（例如，请参见图1）。为了成像来自该倾斜平面的荧光，他们使用类似于斜面显微镜的方法旋转了物镜的成像平面，以精确地将相机聚焦。3Hillman和她的团队使用物镜上游的扫描镜来将光板侧面的扫描镜移至侧面，从而将荧光返回荧光，以使荧光保持在移动的光板上。通过在镜子移动时堆叠平面，显微镜可以快速并反复生成天博体育app卷的图像。
Scape 2.0的几个细节（见图2）值得说明。通过将捕获的荧光传输以使用第二个客观镜头将捕获的荧光传递以在中间点形成真实的斜图像，可以解决倾斜平面（即，与观察轴角度角度的光板）天博体育app的问题。然后，通过第二个物镜镜头捕获该图像，以一定角度（约127°）排列，以将光板平面的平面聚焦到相机上。
图2： 可移动对准镜是Scape 2.0的关键元素之一。
摄像机上的最终图像是从样品中的倾斜Y-Z平面，通常是矩形；由于光渗透到大多数组织中，因此在z方向上（vs. y）狭窄。在此类样本中，操作相机仅读取减少的行数（对应于Z中的深度）是很有用的，因为这允许更高的速度天博体育app（例如，根据相机使用的相机，可以在1000至18,000 fps之间读取200行。
首先通过使用多边形镜来扫描轻板，首先解决扫描同步问题。检测路径涉及相邻激发灯使用的方面。希尔曼（Hillman）解释说：“这个多边形是Scape的原始灵感，但我们很快意识到，使用单个电量表镜像更简单，同样有效。这种更改使系统更容易且便宜地构建，可以使更多的光线返回相机，并且可以更轻松地控制系统的扫描模式。”。”。
除了Galvo镜外没有运动部件，Scape的总速度仅受摄像头框架速率和信噪比（SNR）的限制。根据特定的实验，将Galvo镜在10到100 Hz之间进行扫描，对应于前所未有的每秒10-100卷（VPS）。 Scape使用常规的锯齿扫描模式，即线性扫描，然后是几乎是固定的重置。 Galvo扫描的幅度以及每次扫描的摄像头数量，确定系统的视野和采样密度在X方向上。可以利用更快的相机来提高量速率，采样密度或视场。尽管大多数团队的天博体育app都使用了标准的SCMOS摄像机，但他们使用具有集成增强器的Ultrafast CMOS摄像机达到了300多个VPS天博体育app。
因为灯板与图像观看轴Z角度扫描，所以每个深度切片相对于下一个切片略有偏移。显微镜的计算机使用一个简单的转换来纠正此“偏斜”并生成未变形的天博体育app图像卷。
数字激光调制
对多个荧光团（包括功能指示剂和荧光蛋白）的并发监测可以使动态行为（例如肌肉作用）与分子组成，细胞结构，神经信号等相关。 Scape通过提供多波长的激发来支持此类应用程序-VIA插件COHERENT OBIS光学泵送半导体激光器（OPSL）- 同时获得两个或更多频谱分离的图像并排并排上的选项。
Hillman与早期的激光类型相比，这项工作对OPSL技术的一些创新优势。她指出了广泛的可用波长和功率水平。 “几年前，我们有488 nm，532 nm和638 nm，如果您想要可用的功率水平，那就是这样。我们在黄色和橙色中别无选择。但是，今天，我们可以选择具有数十毫米的激光来源，这些激光源几乎与任何常见的可用荧光酚的激发非常匹配。”她解释说，他们的大多数Scape系统都集成了多个自由空间激光器，使它们比纤维耦合更灵活。 “非常方便的是，激光是紧凑的，并且都具有相同的外形和相同的电子界面。”希尔曼说，迄今为止，他们在某些实验中使用了多达五个激光波长。她还解释说，她定期参加研讨会和课程，并使用可用的OBIS激光器，其重新调整很少。
数字天博体育app是OPSL的另一个重要特征。由于可以以高达25 kHz的速度打开和关闭OPSL，因此可以在具有精确时机的连续帧上交替使用激发波长。使用实验室构建的图像切片，由二分色过滤器和镜子组成的多波长检测来补充。该设备投射了具有高达1280素宽的视野的光谱分离图像，与单波长的操作相比，对天博体育app速度没有影响。
演示功率和范围
两项最近的合作研究说明了scape的力量和范围。
小生物的天博体育app - 包括身体，大脑和神经系统的整体 - 是神经科学的趋势。希尔曼（Hillman）及其同事最近发表了一项研究，描述了它们对活果蝇幼虫中遗传编码和钙敏感荧光蛋白的高速天博体育app（见图3）。除了捕获蠕动爬行期间幼虫的身体和神经系统的复杂动态外，该团队还跟踪了随着身体壁的变形而沿着身体壁沿着的神经元如何发射的。
该团队还使用SPAPE研究了活啮齿动物Cortex5中神经元树突的动态射击，而鼠标鼻子中的嗅觉感官神经元6，6，自由地移动c。秀丽隐杆线 蠕虫。更重要的是，他们制作了戏剧性的杀伤性，胚胎斑马鱼的心脏。2
胚胎斑马鱼心脏的研究可以提供对脊椎动物心脏发育的见解，包括遗传和环境因素对结构和功能的影响。传统的显微镜需要时间门控，不可避免地会错过细节，例如不规则心律失常，因为自然心率为2至4 Hz，并且无法对红细胞（RBC）流量分析执行完整的4D粒子跟踪。希尔曼（Hillman）的团队与儿科心脏病专家金拉·塔戈夫（Kimara Targoff）教授合作，他的实验室使用斑马鱼破译了可能导致胚胎心脏畸形的基因突变。协作努力捕获了两种红细胞以超过100 vps的跳动心形的视频，并利用GCAMP标签来捕捉跨跳动心脏的钙活动的单个波（见图4）。
图3：在这三个图像中，在10 vps [3]腹侧本体感受性神经元捕获的移动果蝇幼虫中，用GFP标记并使用488 nm激发进行天博体育app。颜色（从黄色到蓝色）表示从不同深度到样品的信号。有关详细信息，请参见R. Vaadia等。 [4]有关这项研究的实时视频序列，请参见http://bit.ly/scape2019。
图4：以100 vps捕获的斑马鱼的心脏，该视频是由视频绘制而来的。顶部面板显示Z细节和底部面板显示X细节。心脏的心室开始压缩，流出阀打开，然后在连续的图像中从中庭填充。心脏壁的内皮细胞用EGFP（绿色）标记，而红细胞则标记为dsred（红色）。两种荧光团都用488 nm激光（样品处于0.6 MW）激发。有关视频在内的完整详细信息，请参见V. Voleti等。 [2]
摘要
在整个生命科学中，荧光显微镜被用作一种工具，使研究人员可以连接分子，细胞，器官和生物体水平的事件。现在有能力在生命速度（4D显微镜）下记录高分辨率多色（天博体育app）图像的能力，现在已经准备在加速这项研究中发挥关键作用。
参考
参考
1。 M. B. Bouchard等人，nat。光子学，9，2，113–119（2015）。
2。 V. Voleti等人，nat。方法，16，10，1054–1062（2019）。
3。 C. Dunsby，选择。表达，16，25，20306–20316（2008）。
4。 R. Vaadia等人，Biorxiv，467274（2018）。
5。 E. M. Hillman等人，Curr。意见。 Neurobiol。，50，190–200（2018）。
6。 L. Xu等，Science，368，6487，eaaz5390（2020）。