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天博体育app 与连贯的轴突780纤维激光的两光子代谢FLIM

天博体育app＆Hickl GmbH - 光子计数设备的技术领导者 - 早些时候表明，小型飞秒光纤激光器可以用作多型荧光成像系统的廉价激发源。发射波长为780 nm，40 MHz至80 MHz脉搏率，平均功率为100 mW至500 mW，激光器不仅适合于激发NAD（P）H（P）H（P）H（P）H，还适用于其他多种荧光团[1，2]，包括极短的荧光寿命[3，4，4，5]。

天博体育app＆Hickl因此有兴趣了解如何Axonfomtsecond纤维激光器将在这些应用中执行。

图1

图。 1：连贯的轴突780飞秒激光

 

系统体系结构

作为一个测试系统，他们使用了BH DCS-120 MP多光量系统。该系统的体系结构如图2所示。

图2
图。 2：多光子激光扫描FLIM系统的原理
轴突780激光的激光光束通过游离光束注入DCS-120扫描头部。在扫描头部内部，它被两个快速的电量计镜偏转。扫描头的扫描镜头将激光束投射到显微镜上。在显微镜内部，光束通过二分束分离器，并投射到显微镜镜头的背孔上。显微镜物镜将光束聚焦于样品内部的图像平面。由于射流器偏转梁，电流仪反映了样品中图像区域上的激光聚焦栅格扫描。

 

对于最大空间分辨率，激光束完全填充显微镜镜头的背光很重要。鉴于扫描和管镜的通常焦距，这并非自动。因此，在进入扫描仪之前，将梁扩展到一个因子1.5。后光圈中的光束直径约为12 mm，足以填充最大显微镜镜头的光圈。过度填充光圈是无误的。激发能力的相关损失可以容忍，因为激光的功率远远超过所需的功率。

来自样品的荧光通过显微镜镜头收集，并通过非散布的梁路径喂养。 L1和L2形成潜望镜。潜望镜还收集光子，这些光子并非由显微镜镜头完美准确，例如光子散布在厚样品中的路上。荧光将其分为两个波长间隔，并通过两个BH HPM-100-40杂交探测器检测[6，7]。来自检测器的单光子脉冲记录在两个SPC-180N TCSPC / FLIM模块中[1]。 SPC-180N模块确定激发脉冲后光子的检测时间和扫描仪的位置在光子检测瞬间。此信息用于构建Flim图像。这些是像素的阵列，每个像素都包含大量时间通道中的全荧光衰减曲线[1]。

在飞回阶段扫描激光束和光束遮挡，由BH GVD-140扫描控制器卡通过硬件控制。激光强度控制是通过轴突激光器的AOM控制信号输入进行的。该信号也由GVD-140卡提供。整个系统由BH的SPCM数据获取和控制软件[1]运行，提供了一个完全集成的FLIM系统，并具有扫描仪控制，激光控制，数据采集和数据分析。 FLIM系统的用户界面如图3所示。

图3
图。 3：SPCM数据采集和控制软件的主面板

 

结果

用DCS-120-Axon组合拍摄的FLIM图像如图4至图6所示。所有图像使用40倍，Na = 1.3油浸入式透镜。使用BH Spcimage NG FLIM数据分析套件进行数据分析。图4和图5显示了平均（振幅加权）寿命和代谢指标A1的颜色编码的FLIM图像。所选图像参数（TM或A1）的直方图显示为右上，光标位置处的衰减曲线显示为右下。选定位置的衰减参数显示很正确。

图4
图。 4：猪皮，纳德图像，双指数衰减的振幅加权平均寿命

 

图5
图。 5：快速衰减成分的猪皮，nadh图像，振幅，A1。 A1是代谢状态的指标

 

图。 6显示酵母细胞。选择发射过滤器以检测440 nm至470 nm，从而限制了光谱范围以检测NAD（p）h。 470 nm的上部检测极限可能看起来非常限制。但是，为了避免FAD和FMN荧光的检测，需要限制小于470 nm。这些化合物与NAD（P）H一起激发，但对代谢状态显示出不同的依赖性。通过spcimage ng的MLE算法分析数据，在图像的各个像素中提供了高准确的双指数衰减参数。显示的图像显示A1，即快速衰减成分的幅度。它表示未结合的NAD（p）h的量。由于界限/未结合比随代谢而变化，因此A1也称为“代谢指标” [1]。

 

可以看出，在不同的单元格中，A1显然是不同的。这表明不同细胞中的代谢状态不同。高A1（显示的蓝色）表明代谢更为糖酵解，低A1（黄色）表明它更具有氧气。

图6
图。 6：快速衰减成分的酵母单元，NADH图像，振幅，A1，代谢状态的指标
 
‘我们已经证明了相干轴突780 femtsecond纤维激光器，结合了BH的精确扫描仪光学元件，探测器，TCSPC/FLIM电子设备，并且数据分析软件在现场细胞和组织的代谢中提供了准确的信息。具有内部AOM强度控制激光器在BH的SPCM FLIM采集软件中平稳集成。光束挡板处于横梁停机状态和扫描仪反射阶段，可再现强度控制可保护样品免受局部光损伤的影响。总而言之，DCS-1220 MP/Axon 780组合是一种易于使用的高分辨率，高敏性，两光子激光扫描FLIM显微镜。 

 

参考

  1. w。 Beker，BH TCSPC手册。第十版。 天博体育app＆Hickl GmbH（2023），可在www.天博体育app-hickl.com上找到，可从BH获得印刷副本
  2. w。贝克尔（C.申请注释，可在www.天博体育app-hickl.com上找到
  3. w。贝克尔（C.申请注（2021），可在www.天博体育app-hickl.com上获得
  4. w。 天博体育app，A。Bergmann，C。Junghans，天然类胡萝卜素中的超快速荧光衰减。申请注，www。 天博体育app-hickl.com（2022）
  5. w。贝克尔（C.申请注，www。 天博体育app-hickl.com（2023）
  6. w。贝克尔（B.麦res。技术。 74，804-811（2011）
  7. 天博体育app＆Hickl GmbH，低于混合探测器和MCP-PMT的20PS IRF宽度。申请注释，可在www.天博体育app-hickl.com上找到
“我们已经证明了相干轴突780 femtsecond纤维激光器，结合了BH的精确扫描仪光学元件，检测器，TCSPC / FLIM电子设备，以及数据分析软件在现场细胞和组织的代谢中提供准确的信息。”

- 沃尔夫冈·贝克尔（Wolfgang 天博体育app），贝克尔（天博体育app＆Hickl）董事总经理，德国柏林

 

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